【正文】 速度下分析樣品需要很長(zhǎng)時(shí)間，一般來(lái)說(shuō)都選在1mm/s的條件下操作。③改善傳質(zhì)過(guò)程。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。這是由于在一個(gè)流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。3）傳質(zhì)阻抗（mass transfer resistance）。在低流速時(shí)，它對(duì)峰形的影響較大。又稱(chēng)縱向擴(kuò)散。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，λ越小。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。 由流出曲線(xiàn)方程對(duì)V(0~∞)求積分，即得出色譜峰面積A。②當(dāng)進(jìn)樣量一定時(shí)，σ越?。ㄖг礁撸甯咴礁?，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。 雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過(guò)程不符，如色譜過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，很難達(dá)到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的。4） 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無(wú)關(guān)。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過(guò)程看成在分餾塔中的分餾過(guò)程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過(guò)程。高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程(三) 二、塔板理論1．塔板理論的基本假設(shè)這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來(lái)實(shí)現(xiàn)。②增加選擇性。R＝，稱(chēng)為6σ分離，%。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。 要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α又稱(chēng)為相對(duì)保留時(shí)間（《美國(guó)藥典》）。 容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)是：K取決于組分、流動(dòng)相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無(wú)關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。R＝0；k越大，說(shuō)明固定相對(duì)此組分的容量越大，出柱慢，保留時(shí)間越長(zhǎng)。容量因子(capacity factor，k)化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的量之比。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。實(shí)際應(yīng)用時(shí)往往用柱長(zhǎng)L和理論塔板數(shù)計(jì)算。（一般HPLC柱的N在1000以上。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。R＝tR－t0調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，V39。在實(shí)驗(yàn)條件（溫度、固定相等）一定時(shí)，t39。又稱(chēng)洗脫體積。其中只有Vm參與色譜平衡過(guò)程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。即流動(dòng)相（溶劑）通過(guò)色譜柱的時(shí)間。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說(shuō)明組分在流出色譜柱過(guò)程中的分散程度。峰寬（peak width，W)峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線(xiàn)與基線(xiàn)的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離?！吨袊?guó)藥典》~。不對(duì)稱(chēng)色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來(lái)也會(huì)產(chǎn)生漂移。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。 分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。 高～中正相色譜法與反相色譜法比較表 隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。常用于分離同分異構(gòu)體。 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。 高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱(chēng)高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。*參考(標(biāo)準(zhǔn)JB522691)液相色譜儀測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。 柱性能測(cè)試： 因柱效是柱中流動(dòng)相線(xiàn)性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。 c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)： a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。如色譜柱通過(guò)流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象，請(qǐng)用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1／4圈，直至不漏液為止。、。 b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。 常用的其它的反相填料還有鍵合CCC苯基等，其顆粒粒徑在3—10 μm之間。 反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 μm的范圍內(nèi)。 液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類(lèi)是依據(jù)填料類(lèi)型而定。3／16英寸的內(nèi)螺紋與1／16英寸()的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。: 解 決 方 法(尖銳峰) : 流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓 (隨機(jī)噪聲) : 清洗柱,凈化樣品,用HPLC級(jí)試劑 : 更換氘燈 (偶然噪聲) : 采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來(lái)源(如水浴等) : 流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓 (七)峰拖尾可能的原因: 柱恒溫 : 至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱 : 用25mmol/L的緩沖液 : 每天沖洗柱 : 穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相 : 采用保護(hù)柱 (二)保留時(shí)間縮短可能的原因 : 解 決 方 法 : 檢查泵,重新設(shè)定流速 : 降低樣品量 : 流動(dòng)相PH值保持在3~ : 防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀 : 柱恒溫 (三)保留時(shí)間延長(zhǎng)可能的原因因此，樣品進(jìn)入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管、檢測(cè)器）中，樣品分子的擴(kuò)散和滯留，都會(huì)引起色譜峰的展寬，而使柱效降低 。更換色譜柱時(shí)要注意什幺事項(xiàng)?但是在比例閥的混合點(diǎn)，重力作用使鹽顆粒沉淀下來(lái)，通常，閥A接水相/鹽溶液，D接有機(jī)溶劑，此法連接可有效使鹽回落到鹽溶液中，并被溶解。使用梯度比例發(fā)時(shí)要注意那些事項(xiàng)？（當(dāng)打開(kāi)Purge Valve時(shí)，壓力高于10bar，表明過(guò)濾芯已堵）。A：流動(dòng)相使用前請(qǐng)必須脫氣、過(guò)濾。Agilent 1100LC泵如何維護(hù)？以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑過(guò)濾器的堵塞。如何防止溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑過(guò)濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。氣泡會(huì)增加基線(xiàn)的噪音，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。流動(dòng)相使用前為什幺要脫氣？ 毛細(xì)管線(xiàn)分類(lèi)： 綠色 。以23滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過(guò)濾。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。帶sealwash的 1100，要配制90%水+10%異丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，溶劑不能干涸。 退出化學(xué)工作站，及其它窗口，關(guān)閉計(jì)算機(jī)（用shut down關(guān)）。 ● (3)、單擊Ok.(3)、如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)，直到滿(mǎn)意為止。 積分: 反復(fù)進(jìn)行，直到圖的比例合適為止。 1等儀器Ready，基線(xiàn)平穩(wěn)，從Method菜單中選擇“Run method”，進(jìn)樣。 區(qū)別: ● “Peak width”：大多數(shù)應(yīng)用設(shè)為4s，只有快速分析采用小的設(shè)定值。 Emission: ● 用甲醇稀釋為1:10。 若環(huán)境溫度不穩(wěn)定,則設(shè)定光學(xué)單元溫度為高于環(huán)境溫度5度,以防樣品在池中沉淀。 峰寬(響應(yīng)時(shí)間) : Off 。選中所用的燈。參比帶寬BW：至少要與樣品信號(hào)的帶寬相等，許多情況下用100nm作為缺省值。 在”P(pán)eak width (Response time)”下方點(diǎn)擊下拉式三角框,選擇合適的響應(yīng)時(shí)間, 如 ●點(diǎn)擊ok進(jìn)入下一畫(huà)面。 柱溫箱參數(shù)設(shè)定: ●點(diǎn)擊Ok進(jìn)入下一畫(huà)面?！襁x擇合適的進(jìn)樣方式, 進(jìn)樣體積 ,洗瓶位置為6號(hào)。 ●在“Flow”處輸入流量,如1ml/min，在“Solvent B”,(A=100B) ,也可Insert 一行”Timetable” ,編輯梯度。單擊Ok。 valve。 單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pump control選項(xiàng)，選中On，單擊OK，則系統(tǒng)開(kāi)始Purge，直到管線(xiàn)內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無(wú)氣泡為止,切換信道繼續(xù)Purge，直到所有要用信道無(wú)氣泡為止。 把流動(dòng)相放入溶劑瓶中。 打開(kāi) 1100 LC 各模塊電源。HPLC系統(tǒng)SOPWaters高效液相色譜系統(tǒng)操作規(guī)程高效液相色譜儀(Agilent 1100)操作注意事項(xiàng)色譜掃盲班Agilent1100高壓液相色譜儀基本操作步驟Agilent1100液相基本操作步驟(一)、開(kāi)機(jī)：600E2487 打開(kāi)計(jì)算機(jī),進(jìn)入Windows NT （或Windows 2000）畫(huà)面,并運(yùn)行Bootp Server程序。 打開(kāi)Purge閥。 單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pump Control選項(xiàng)，選中Off，單擊Ok關(guān)泵， 關(guān)閉Purge 1單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setup pump選項(xiàng)，進(jìn)入Pump編輯畫(huà)面，設(shè)Flow：。也可輸入停泵的體積。 ●單擊Ok 進(jìn)入下一畫(huà)面。 泵參數(shù)設(shè)定：（以二元泵為例） 單擊Ok進(jìn)入下一畫(huà)面。 自動(dòng)進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)定:“Use injector program”可以點(diǎn)擊Edit 鍵進(jìn)行進(jìn)樣程序編輯。 ●在”Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測(cè)波長(zhǎng),如254nm,點(diǎn)擊ok進(jìn)入下一畫(huà)面。 DAD檢測(cè)器參數(shù)設(shè)定: 參比波長(zhǎng)：一般選擇在靠近樣品信號(hào)的無(wú)吸收或低吸收區(qū)域。同時(shí)可以輸入采集光譜方式，步長(zhǎng)，范圍，閾值。 ●點(diǎn)擊Ok進(jìn)入下一畫(huà)面。 ●色譜條件: 光學(xué)單元溫度:2℃,設(shè)定為Off,手動(dòng)purge 參比池，將其設(shè)為On，并輸入Purge 時(shí)間。 樣品：P/N 0101868704 進(jìn)樣體積：5ul。 ● 30℃ ?！?● Multi Ex ： 多波長(zhǎng)及光譜（激發(fā)）。 ● 在“ Run time checklist ”中選中“Data acquisition”，單擊Ok。 1從菜單 “View”中選中”O(jiān)nline signal” ,選中Windows 1,然后單擊Change 鈕,將所要繪圖的信號(hào)移到右邊的框中,點(diǎn)擊Ok.(如同時(shí)檢測(cè)二個(gè)信號(hào),則重復(fù)12,選中Windows 2)。 1從Instrument 菜單選擇System on。從Ranges中選擇Auto scale及合適的顯示時(shí)間，單擊ok,或選擇”Use Ranges” 調(diào)整。 (1)、從“Report”菜單中選擇“Specify report”選項(xiàng)，進(jìn)入如上畫(huà)面。(四)、關(guān)機(jī): ●流動(dòng)相使用前必須過(guò)濾，不要使用多日存放的蒸餾水（易長(zhǎng)菌）。維護(hù)知識(shí)問(wèn)答為什幺溶劑和樣品要過(guò)濾?色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過(guò)濾，,材料為纖維素。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。,必須使用該在線(xiàn)沖洗選項(xiàng). 90%水+10%。為使柱外效應(yīng)減之最小，獲得理想的分析結(jié)果，Agilent 1100LC 使用加工工藝難度高的毛細(xì)管線(xiàn)作為流動(dòng)相管路。 流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。在線(xiàn)真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)， 在線(xiàn)脫氣，智能控制，無(wú)需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。 溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類(lèi)的生長(zhǎng)會(huì)堵塞溶劑過(guò)濾器，從而影響泵的運(yùn)行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=4—7）。