【正文】 。 5 細(xì)胞融合常用的方法有哪些？各有什么優(yōu) 缺點(diǎn)？ 仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段： ①兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在 4℃條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。 大量培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的三種方法 : ①微導(dǎo)管培養(yǎng)法 由硝酸纖維素或醋酸纖維素制外徑小于 l mm 的多層微導(dǎo)管床浸沒(méi)于培養(yǎng)基中。二甲亞砜（ DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的 formazan 量成正比。 生殖性克隆：通過(guò)代孕母親產(chǎn)生與供體在遺傳上完全一致的新 生個(gè)體 治療性克?。菏侵赴芽寺〕鰜?lái)的組織或者器官用于治療疾病 3 培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定的方法有哪些？各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？ 1） 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞在體外增殖 6 代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為有限細(xì)胞系；已獲無(wú)限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系。 2 基本概念：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、原代培養(yǎng)、傳代、細(xì)胞系、有限細(xì)胞系、無(wú)限細(xì)胞系、細(xì)胞株、細(xì)胞融合、核移植技術(shù)、治療性克隆、生殖性克隆 細(xì)胞培養(yǎng) ： 指的是離體細(xì)胞在無(wú)菌培養(yǎng)條件下的分裂、生長(zhǎng)，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織。 個(gè)體化的藥物治療：藥物基因組學(xué)。 對(duì)生物技術(shù)的貢獻(xiàn) 胚胎細(xì)胞克隆技術(shù)：（ 1）基因工程藥物 分泌蛋白（多肽激素，生長(zhǎng)因子，趨化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受體。對(duì)于 單基因病 ，采用?定位克隆?和?定位候選克隆?的全新思路，導(dǎo)致了 亨廷頓舞蹈病 、遺傳性 結(jié)腸癌和 乳腺癌 等一大批單基因遺傳病致病基因的發(fā)現(xiàn)，為這些疾病的基因診斷和 基因治療 奠定了基礎(chǔ)。例如，用產(chǎn)甲烷菌作為一種新能源?；蚪M學(xué)的研究?jī)?nèi)容 :結(jié)構(gòu)基因組學(xué) 、 功能基因組學(xué) 、 蛋白質(zhì) 組學(xué) 結(jié)構(gòu)基因組學(xué) :基因定位 、 基因組作圖 、 測(cè)定核苷酸序列 功能基因組學(xué) :又稱后基因組學(xué)，基因的識(shí)別、鑒定、克隆 。 12)．接合轉(zhuǎn)移法 是借助于某些質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)移基因產(chǎn)物，適用于細(xì)菌之間和細(xì)菌與植物細(xì)胞間 13)．超聲波法 現(xiàn)已用于植物細(xì)胞，可能還可用于其它生物 14). 基因槍法 14 什么是基因組、基因組學(xué)？基因組學(xué)研究?jī)?nèi)容包括哪幾個(gè)方面？簡(jiǎn)述每個(gè)方面的研究?jī)?nèi)容。 pBS+， pUC118, pUC119 3) 各種質(zhì)粒 d sDNA 定序系統(tǒng)。 用途：用于終止子序列的分離與鑒定。在大多數(shù)載體中，檢測(cè)基因不僅被除去了啟動(dòng)子序列，其翻譯起始區(qū)也被除去（ II 型），有的則僅僅除去了轉(zhuǎn)錄起始區(qū) （ I 型）。 2) 結(jié)構(gòu) : a. 轉(zhuǎn)化單元 宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化 b. 表達(dá)單元 外源基因表達(dá) 3) 類型 : Ⅰ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列 +啟動(dòng)子） + 終止子 Ⅱ型 : 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子 + 翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子） + 終止子 Ⅲ型 : 轉(zhuǎn)錄起始區(qū) + 翻譯起始區(qū) + 信號(hào)肽鏈編碼區(qū) + 終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體） （ 3） 失控型質(zhì)粒載體 ： 1) 溫控型 2) 藥物控制型 （ 4） 探針型載體 主要特點(diǎn)是含有一些特殊的 DNA 序列，用于特定的研究目的，如分離基因啟動(dòng)子、終止子、 DNA 復(fù)制起點(diǎn)和染色體端粒的分 離與鑒定，或是用于制備標(biāo)記探針等。 2) 用途 : 基因組或 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建 。 如：對(duì)于藥物抗性標(biāo)記基因，可提高藥物濃度。 標(biāo)記基因的種類 1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） a. 抗 生素抗性基因 ； b. 重金屬抗性基因 : Cur ， Znr ， Cd r c. 代謝抗性基因 : TK，抗除草劑基因 2）營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營(yíng)養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如 TRP1， URA3， LEU2， HIS4 等。 幾種重要的 DNA 聚合酶及其基本用途 ： （ 1） 大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 基本性質(zhì)： 5’→ 3’的 DNA 聚合酶活性； 5’→ 3’的核酸外切酶活性； 3’→5’的核酸外切酶活性 大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 大片段（ Klenow ）基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的 5’粘性末端； DNA 片段的同位素末端標(biāo)記 ； cDNA 第二鏈的合成； 雙脫氧末端終止法測(cè)定 DNA 序列 2） T4DNA 聚合酶 T4DNA 聚合酶的基本特性： 5’→ 3’的 DNA 聚合酶活性和 3’→ 5’的核酸外切酶活性；在無(wú) dNTP 時(shí)，可以從任何 3’ OH 端外切；在只有一種 dNTP 時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止；在四種 dNTP 均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位 T4DNA 聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的 3’粘性末端，該酶也能降解雙鏈 DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多 3） T7 噬菌體 DNA 聚合酶 基本特性： 5’→ 3’的 DNA 聚合酶活性和 3’→ 5’的核酸外切酶活性；已知 DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)；改造后成為雙脫氧終止法對(duì)長(zhǎng)片段 DNA 的測(cè)序酶 基本用途：用于拷貝長(zhǎng)段模板的引物延伸反應(yīng)；通過(guò)補(bǔ)平或交換（置換）反應(yīng)進(jìn)行快速末端標(biāo)記；給載體或目的 DNA 加上互補(bǔ)的同聚物尾； DNA 片段 3’末端的同位素標(biāo)記 4）依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶） 基本特性：以 RNA 為模板聚合 cDNA 鏈；雙向外切 DNARNA 雜合鏈中的 RNA 鏈 基本用途：將真核基因的 mRNA 轉(zhuǎn)錄成 cDNA，構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)；對(duì)具有 5‘突出端的 DNA 片段的 3’端進(jìn)行補(bǔ)平和標(biāo)記、制備探針；代替 Klenow 片段，用于 DNA 序列測(cè)定 5）耐熱 DNA 聚合酶（ Taq 酶） Taq 酶的特點(diǎn)：熱穩(wěn)定性；離子依耐性； 忠實(shí)性： 5’ 3’聚合酶活性和 5’3’外切酶活性 8 平末端 DNA 片段的連接方法包括哪幾種？ 4 種： （ 1）直接用 T4 DNA 連接酶連接； （ 2）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端 DNA 分子加上同聚物尾巴之后再用 DNA 連接酶進(jìn)行連接； （ 3）用銜接物連接平末端 DNA 分子；（ 4） DNA 接頭連接法。 6 限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)有哪些？影響其活性的因素有包括哪些方面？ 特點(diǎn)： 1） 識(shí)別位點(diǎn)的 DNA 序列具有回文結(jié)構(gòu)； 2） 切割 DNA 均產(chǎn)生含 5’磷酸和 3’羥基的末端； 3） 錯(cuò)位切割產(chǎn)生粘端，沿對(duì)稱軸切割產(chǎn)生平末端； 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 ： 1） DNA 樣品的純度：加大酶的用量， 1 mg DNA 用 10U 酶； 加大反應(yīng)總體積 ； 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 2） DNA 樣品的甲 基化程度：識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化會(huì)強(qiáng)烈抑制限制酶的活性 ， 因此在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌株 3） DNA 的分子結(jié)構(gòu) 某些限制性核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒 DNA 或病毒 DNA 所需要的酶量，要比消化線性 DNA 的高出許多倍。 5 解釋同裂酶、同尾酶 同裂酶（同切酶或異源同工酶） ： 有些來(lái)源不同的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見(jiàn)的是 4 個(gè)或 6 個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別 5 個(gè)核苷酸 4 什么是回文結(jié)構(gòu)、粘性末端、平末端、位點(diǎn)偏愛(ài)、星號(hào)活性？ 回文結(jié)構(gòu)：序列正讀和反讀是一樣的，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝兩個(gè)方向讀序列是完全一樣的。 第三類（ III 型）限制性內(nèi)切酶也有專一的識(shí)別順序，在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。 1) 分離純化過(guò)程 破碎細(xì)胞 + DNA 抽提液 (EDTA、去污劑、還原劑 ) 65℃溫育 20min 冰浴冷卻 離心去細(xì)胞碎片 苯酚抽提法（方法①）、 CsCl 密度梯度離心（方法②） 2） 兩種方法比較：上述兩種分離方法都包含了下述四個(gè)分離步驟 可溶與不可溶物分離：高速離心除去細(xì)胞碎片，保留上清液；使蛋白質(zhì)分離：苯酚抽提或超速離心 ； 使 RNA分離： RNase 處理或超速離心；使 DNA 與其它可溶物分離 CsCl 法操作步驟少，分離 DNA 分子量大，但耗財(cái)多，且需超速離心機(jī)。 聯(lián)系：現(xiàn)代生物技術(shù)的研究是以傳統(tǒng)生物技術(shù)為基礎(chǔ)。 生物技術(shù)在環(huán)保方面的應(yīng)用： （ 1）污染監(jiān)測(cè) 現(xiàn)代生物技術(shù)建立了一類新的快速準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)環(huán)境的有效方法，主要包括利用新的指示生物、利用核酸探針和利用生物傳感器。 生物技術(shù)在醫(yī)藥方面的應(yīng)用： 目前，醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域是現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用得最廣泛、成績(jī)最顯著、發(fā)展最迅速、潛力也最大的一個(gè)領(lǐng)域，生物技術(shù)貫穿了疾病預(yù)防、診斷和治療的整個(gè)過(guò)程。科學(xué)家已經(jīng)培育出多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，它們的乳腺能特異性地表達(dá)外源目的基因，因此從它們產(chǎn)的奶中能獲得所需的蛋白質(zhì)藥物，這種生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的方式叫做乳腺生物反應(yīng)器。 （ 3） 農(nóng)業(yè)新領(lǐng)域 傳統(tǒng)意義上的農(nóng)業(yè)是向我們提供食物和工業(yè)原料，而基因工程不僅提高了農(nóng)牧產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且一些轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物有了遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出僅供食用的價(jià)值 —— 生產(chǎn)藥物。其次，生物技術(shù)還能改良作物品質(zhì)。第三，利用生物技術(shù)可開(kāi)發(fā)出新的材料類型。其次，生物技術(shù)可以提高食品質(zhì)量。第一章 生物技術(shù)概論思考題 什么是生物技術(shù)？它包括那些內(nèi)容？ 生物技術(shù)（ 生物工程），是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，采用先進(jìn)的工程技術(shù)手段，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或者加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。 ) 生物技術(shù)在工業(yè)方面的應(yīng)用： （ 1）食品方面 首先，生物技術(shù)被用來(lái)提高生產(chǎn)效率，從而提高食品產(chǎn)量。其次，生物技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)一些稀缺生物材料提供了可能。 生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用： (1)農(nóng)作物和花卉生產(chǎn) 首先，生物技術(shù)既 能提高作物產(chǎn)量，還能快速繁殖花卉。其次，生物技術(shù)可以培育抗病的畜禽品種，減少飼養(yǎng)業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)。 。促紅細(xì)胞生成素（ EPO）能促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，對(duì)腫瘤化療以及腎臟機(jī)能下降引起的紅細(xì)胞減少具有積極的治療作用。 （ 3） 疾病治療 生物技術(shù)在疾病治療方面主要包括提供藥物、基因治療和器官移植 等方面。 ,它具有高技術(shù)的 六高 特征是指哪 六高 ？ ?六高?特征是 高效性 、 高智力 、 高投入 、 高競(jìng)爭(zhēng) 、 高風(fēng)險(xiǎn) 、 高勢(shì)能 （高勢(shì)能指 對(duì)國(guó)家的政治，經(jīng)濟(jì)、文化和社會(huì) 發(fā)展具有很大的影響，具有很強(qiáng)的滲透性和擴(kuò)散性 . 1） 前生物工程（經(jīng)驗(yàn)生物工程）時(shí)期：從公元前 7000 年 1593 年（明朝末年） 2） 古典生物工程時(shí)期：荷蘭人發(fā)明顯微鏡 3） 實(shí)驗(yàn)生物工程時(shí)期 ： 1953 年發(fā)現(xiàn) DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu) ； 19611966 破譯遺傳密碼 ； 1970 分離出第一個(gè)Ⅱ類限制性內(nèi)切酶 ； 1972 DNA 體外重組技術(shù)建立 ； 1975 建立雜交瘤技 ； 1976 DNA 測(cè)序技術(shù)誕生 ； 1978 第一次生產(chǎn)出基因工程胰島素 ； .........1986 第一個(gè)轉(zhuǎn)基因作物獲批準(zhǔn)田間試驗(yàn) 和 第一個(gè) DNA 重組人體疫苗 (乙肝疫苗 )研制成功 ； 1988 PCR 技術(shù)問(wèn)世 ； 1989 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉花獲批準(zhǔn)田間試驗(yàn) ； 1990 美國(guó)批準(zhǔn)第一個(gè)體細(xì)胞基因治療試驗(yàn) ； 1990 人類基因組計(jì)劃正式啟動(dòng) 、 第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 (鮭魚(yú) )獲批準(zhǔn)養(yǎng)殖 ； 1997 英國(guó)培養(yǎng)出第一只克隆羊?多莉? ； 1998 人體胚胎干細(xì)胞系建立 ； 2020 人類基因組工作框架圖完成 ； 2020 重要糧食作物 —— 水稻基因圖在中國(guó)完成 ； 2020 人類基因組測(cè)序工作完成 區(qū)別：傳統(tǒng)生物 技術(shù)的研究水平是細(xì)胞或組織水平，現(xiàn)代生物技術(shù)的研究水平是在分子水平。 2 簡(jiǎn)述供體 DNA 分離過(guò)程和方法， 并且比較這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)。這類酶如 Eco B、 Eco K 等。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。 星號(hào)活性 （ 星活性 ）： 一些限制性內(nèi)切酶在某些反應(yīng)條件變化時(shí)酶專一性發(fā)生改變，如酶濃度過(guò)高、反應(yīng)液離子強(qiáng)度過(guò)低、 pH 改變、有機(jī)溶劑的影響等條件，酶切割位點(diǎn)專一性發(fā)生改變。常用的 BamHⅠ，BclⅠ， BglⅡ， XhoⅠ就是一組同尾酶，它們切割 DNA 之后都形成由 GATC 4 個(gè)核苷酸組成的粘性末端。 DNA 聚合酶作用的特點(diǎn)： （ 1）要有底物 4 種 dNTP 為前體催化合成 DNA； （ 2）接受模板指導(dǎo)； （ 3）需要有引物（ 3’羥基）的存在； （ 4）不能起始合成新的 DNA 鏈； （ 5）催化 dNTP 加到生長(zhǎng)中的 DNA 鏈 3’ OH 末端； （ 6）催化 DNA 的合成方向是 5’ — 3’。 3) 至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組 DNA 分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞 10 在分子克隆載體中，遺傳標(biāo)記基因的作用是什么？包括哪些種類？ 標(biāo)記基因的作用 :1）指示外源 DNA 分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞 2）指示外源 DNA 分子是否插入載體分子形成了重組子。對(duì)于不同標(biāo)記基因，可采取相應(yīng)方法提高其拷貝數(shù)。 (1).普通型載體 1) 特點(diǎn) : 至少有一個(gè)以上的克隆位點(diǎn)和兩個(gè)標(biāo)記基因，其