【正文】 該用于最大的允許的模板脫氧核糖核酸數(shù)量與 PCR周期一起的有限數(shù)字增 加百分比“改正” PCR產(chǎn)品。 二 .配制反應(yīng)混合體系 。除了引物和 Taq DNA 聚合酶外 , 所有的試劑都須經(jīng)高壓滅菌處理 , 并且要將試劑小劑量分裝貯存在指定的 PCR 反應(yīng)管中 ,并與其他的 DNA 樣品分離開來。 entry clone III. Transformation IV. Protocol: QIAprep Spin Miniprep Kit Using a Microcentrifuge V. DNA ligation VI. DNA gel extraction and purification V II. DNA enzyme digestion V III. GST Fusion Protein Prep 課件與幻燈片 1. 分子生物學(xué)臨床診斷應(yīng)用 2. 非典型肺炎和 AIV PCR 只提供超過 10一個(gè)目標(biāo)脫氧核糖核酸序列的百萬個(gè)拷貝的生產(chǎn)從少量分子。 TA Cloning— to create a Gateway174。 PCR 反應(yīng)試劑應(yīng)該被分開的準(zhǔn)備而且專門為該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的。 設(shè)置這個(gè)反應(yīng)方法使吸取錯(cuò)誤的可能性減到最小并且通過減少試劑調(diào)動的數(shù)量節(jié)省時(shí)間。 5. 安置樣品在 thermocycler,進(jìn)行 PCR. 反應(yīng)混合物的組分 模板 DNA 通常數(shù)量模板脫氧核糖核酸是在 為質(zhì)?；蚴删拿撗鹾颂呛怂岷? g范圍內(nèi)為 genomic 脫氧核糖核酸，為 50μ l總反應(yīng)混合物。 引物 引物設(shè)計(jì)原則： 引物的長度一般以 1530 個(gè)核苷酸為宜 .引物長則特異性高 ； C+G 堿基含量在引物中的比例應(yīng)該控制在 4060%為宜 .引物的 3’端尤其要避免重復(fù)的 CG 堿基序列，否則會使引物在模板的 GC富集區(qū)錯(cuò)誤配對； 兩條引物之間的序列不可互補(bǔ)，以免形成二聚體或發(fā)夾式結(jié)構(gòu) ； 引物兩端的溶解溫度變化不宜超過 5176。 Fermentas 純化試劑盒 dNTP 混合物， 2mM(R0241/2) 和 10mM(R0191/2),方便的在 PCR 中被為直接的使用制定。 反應(yīng)封閉 . 如果有必要，則用半容量的礦物油覆蓋樣品或增加適當(dāng)?shù)南喈?dāng)數(shù)量石蠟油 (熔化的溫度 5060176。若 DNA 變性不完全，則在第一次循環(huán)擴(kuò)增周期模板有效利用率降低和 PCR 產(chǎn)物的準(zhǔn)確度過低中造成模板的失效。 如果 95 176。 C 條件下變性 足以讓 DNA 完全變性了。同時(shí)，由于加入 DMSO 和 formamide 以后，會使 50%Taq DNA Polymerase 的活性受到抑制，因此要求所加入的酶稍多于試劑盒的推薦使用量。然而，如果非特異性 PCR 產(chǎn)物要獲得預(yù)期的產(chǎn)物就要求復(fù)性溫度樓梯式升高 12 176。若擴(kuò)增片段的長度小于 2kb，則延伸時(shí)間大概為 1min，若 DNA 擴(kuò)增片段長度比較大，則延伸時(shí)間按每增加 1000bp 延長 1min計(jì)算 . 循環(huán)次數(shù) 在反應(yīng)混合體系中 PCR 的循環(huán)次數(shù)取決于模板 DNA 的數(shù)量以及 擴(kuò)增反應(yīng)的目的。 C 孵化 515min。 TA Cloning— to create a Gateway174。 實(shí)施階段 使用 PCR Taq polymerase 及你自己的實(shí)驗(yàn)方案。 Cloning reactions 復(fù)制反應(yīng)使用試藥在那 命令顯示。 置于冰上，并導(dǎo)入到活化 E. coli 中。 Cloning 到 One Shot174。 C 孵育 1 小時(shí) 。 ( catalog numbers 19051 號和 19101) 實(shí)驗(yàn)步驟 這一步可以參照 the Qiagen Spin Miniprep Kit 裝備記錄手冊。 這個(gè) 實(shí)驗(yàn) 可以用來純化洗凈來自 1– 5 ml 過夜培養(yǎng)的 E. coli in LB (LuriaBertani) medium 的精確 到 20 μ g的高副本 plasmid DNA。 C 保存 )重懸 pelletedbacterial cells 并將其移至 microcentrifuge 管中，確定 RNase 被增加到 buffer P1 中，要求重懸之後不能看見細(xì)菌球。如果必需的 , 繼續(xù)顛倒 tube 管直到反應(yīng)液變成黏和澄清。 在 tabletop microcentrifuge 中 13,000 rpm (~17,900 x g)離心 10 min。 (可選擇的 ): 加入 ml Buffer PB 沖洗 QIAprep spin column ，離心 30~60sS，去除 flowthrough. 加入 endA+ （如 JM series , HB101 及其派生物、野生型株菌等具有高 nuclease 酶活性或高碳水化合 物的物質(zhì)）。重復(fù)以上步 驟一次，自旋 60S 可獲得高純度的產(chǎn)品。 注意事項(xiàng) : 由于 buffer PE 中剩余的乙醇可能影響后來的生化酶促反應(yīng)，去除 flowthrough，棄去剩余buffer，純化。 為提高 DNA 的濃度 ,可以選擇性的將 30 μ L 水加至 column 中，室溫孵育 5 min，離心 1 min。這可能用 所使用的一些挑剔的酵素有關(guān)系。 洗脫的關(guān)鍵是洗脫液的 pH, 然而要測量 unbuffered 的 pH 很困難。 將溶解產(chǎn)物 column 上過兩次可以將產(chǎn)量提高 20% 。當(dāng)你開始添加 PE后 ,它跟其他反應(yīng)殘余物混在 column 中。這是 OWW 上的主動權(quán) ,請主動提供你的想法并與負(fù)責(zé)人的想法保持一致。這一反應(yīng)通常由 DNA 連接酶催化 。 連接酶反應(yīng)中兩種 DNA 組分的濃度大約是 100μ g/ml。empty39。在平行試驗(yàn)中做更多的嘗試以獲得最好的結(jié)果是非常必要的。 加適量的插入 DNA 序列。 C 變性 10 min . 電穿孔透析 20 min . Use disks shiny side up 20 176。 C過夜。要求所使用的 buffer 味道聞起來像 wet dog( 檢查 DTT 是否完好） 。s 和 tips 尋求幫助 (Ligation T4 DNA ligase)。 進(jìn)行限制性酶切之前使用 proteinase K 處理 PCR 產(chǎn)品可以有效提高接下來的酶聯(lián)反應(yīng) .使用 SYBR Safe DNA Gel Stain 是比較安全，同時(shí)也可以有效減少 ethidium 溴化物的致癌作用。 C貯存 . BINDING TO BEADS AND THROMBIN CLEAVAGE Incubate soluble lysate with 1/2 volume of 50% GST beads at 4C rocking on the Nutator for 3060 minutes. 50 ml conical Falcon tubes work well. Pour into a BioRad Column and drain lysate. Save 100 ul of depleted lysate. Load ul for SDSPAGE. Wash beads with 3 column volumes resuspension buffer and 1 volume thrombin cleavage buffer. Seal the bottom of the column. Add 1 column volume thrombin cleavage buffer plus thrombin. 10ug per mg fusion protein is a good starting point. Incubate 3060 minutes at room temp rocking on the Nutator. If the protein is subject to degradation, try a 60 minute cleavage at 4C. Drain BioRad columns. Soluble cleaved fusion protein will be in the filtrate. Add a column volume of buffer to rinse out all cleaved protein. Rinse and save labelled tubes for reuse. Save about 20 ul of beads. Load 110 ul for SDSPAGE. Optional: a second thrombin cleavage in 1/2 the previous volume. Inactivate thrombin with AEBSF or PMSF. Concentrate on the Centricon or Cell Stirrer if needed, or freeze as is. Save 100 ul of unconcentrated, purified protein. Load 110 ul for SDSPAGE. Quantitate by parison to , , and BSA standards on the same gel. BINDING TO BEADS AND THROMBIN CLEAVAGE Alternate Mini Prep Thaw out 1 ml aliquot of fusion protein lysate. Centrifuge to remove precipitate. Incubate 1 ml lysate with ml 50% GST beads. Incubate at 4C with mixing for 1 hour. Centrifuge 5K 239。 use 1:1000 Kanamycin: , use 1:1000 only for cells with [pREP4] plasmid! ORDERING INFO Sigma: Glutathione beads, cat G4510 Sigma: Thrombin, 3560 NIH units/mg protein, cat T6759