【正文】 有明顯的抑菌圈，直徑 14 mm，表示確診有抑菌物質(zhì)，為陽性，并結(jié)合青霉素酶濾片的抑菌情況來確證是否為青霉素所致 (如 ≤14 mm則為陰性 )。每個平皿放 4個濾片，相互間隔 90176。在使用紙片法進(jìn)行檢測時，每個濃度作 4個平皿，重復(fù) 3次。 國標(biāo) TTC檢測法檢測結(jié)果： 未顯顏色的奶樣有奶樣 4，為陽性，有抗生素存在； 顯微粉色的奶樣有奶樣 12，為可疑對象，可能有抗生素殘留 顯桃紅色的奶樣有奶樣 1 13，為陰性，無抗生素殘留。對照實(shí)驗(yàn)成功。 快速檢測法測得的結(jié)果： 顯紫色的奶樣有奶樣 1 13，為陽性，有抗生素存在； 顯淡紫色奶樣有奶樣 8，為可疑奶樣，可能含有抗生素殘留； 顯黃色的奶樣有奶樣 12，為陰性，無抗生素殘留。翻轉(zhuǎn)平皿，于 (64177。 － 3 0 － 4 0 － 5 0 － 6 0 － 花色奶 7 0 － 8 13177。 ＋ 15 15177。 黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 18 結(jié)果 統(tǒng)計(jì) 以上結(jié)果可以總結(jié)為下表 : 表 34 結(jié)果統(tǒng)計(jì)表 方法 陽性份數(shù) /份 陰性份數(shù) /份 可疑 /份 合計(jì) /份 陽性率 /% TTC法 1 8 4 13 試劑盒法 8 4 1 13 紙片法 2 9 2 13 合計(jì) 11 21 7 39 由上表可以看出，被檢 13份樣品經(jīng)國標(biāo) TTC法檢測出 1份陽性樣品。而國標(biāo) TTC法需 3~ h的檢 測時間；試劑盒法的在 出具體檢測結(jié)果。 TTC法的檢測限值較高，無法適應(yīng)現(xiàn)階段乳制品抗生素的測定需要，且在實(shí)驗(yàn)中不斷的接種翻代使細(xì)菌抗藥性增加，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。 TTC法及紙片法在我國應(yīng)用較多，活性試驗(yàn)在小規(guī)模工廠經(jīng)常使用。同時提高了檢測的廣度 (既廣普性 )、準(zhǔn)確度和精確度。 黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 20 結(jié) 論 本實(shí)驗(yàn)采用三種微生物法檢測牛奶中抗生素的結(jié)果如下： 1. TTC 法檢測陽性率為： % 2. 紙片法檢測陽性率為： % 3. 試劑盒法檢測陽性率為： % 快速檢測法比 TTC法和微生物紙片法的靈敏度要高， 國標(biāo) TTC法 檢測結(jié)果判斷不方便 ；紙片法雖然較準(zhǔn)確但前序工作所耗時間特別長。萊金特 .乳和乳制品中殘留抗生素的檢測方法 [J].中國乳品工業(yè) 2020， 31(4):37 40. [16] 黃怡君 ,姜也文 ,胡松華 ,等 . TTC 法檢測牛奶中的抗菌藥物 [J].中國乳業(yè) ,2020,31(5):57 59. [17] 陳福生，高志賢，王建華．食品安全檢 測與現(xiàn)代生物技術(shù)［Ｍ］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2020:7579． [18] INETAK, BEANDETTH. Interactions of antimicrobials in milk and their detection by the disk diffusion method and DelovtestSP [J].Journal of AOAC international, 2020, 86(3).526533. 黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 22 致 謝 在這短暫的實(shí)驗(yàn)期間，我學(xué)到了很多東西：老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，一絲 不茍的科研精神，淵博的知識，這一切將在我未來的人生和科學(xué)道路上產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。 感謝所有給以我支持和幫助的朋友、同學(xué)們 ! 最后，感謝在百忙之中審閱本文的專 家、老師們 ! 謝謝大家 !黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 23 。 錢鐳老師的悉心教誨，使我在學(xué)術(shù)專業(yè)方面有了一定的提高，更為重要的是，老師在治學(xué)為人上的那份耐心執(zhí)著和熱誠，也深深地影響著我，并將鼓勵我在未來的路上不斷地探索、前進(jìn) ! 在試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，實(shí)施和論文撰寫過程中錢鐳 老師給予了極大的幫助和指導(dǎo)。 黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 21 參考文獻(xiàn) [1] 馬雙青 .消毒奶中抗生素殘留的調(diào)查 [J].中國奶牛 ,2020(6):47,48. [2] 李愛師 .動物性食品中獸藥殘留問題 [J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志 ,1997,15(3):232234. [3] 劉健華 ,陳杖榴．動物性食品中抗菌藥殘留對人體腸道菌群的影響及其研究模型與方法 [Ｊ ].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 ,2020,24(2)3739. 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[12] LINDEMANN G ZUNDEL Test with Triphenyletrazolium Chloride (TTC) as a Method for Bacteriologic Testing of Human Milk[J].Kinderarzu Prax,1957。 當(dāng)前，試劑盒法是最為理想的微生物檢測方法，但產(chǎn)品的價格對中等發(fā)達(dá)國家來講相 對較高。紙片法判斷較簡單，但易出現(xiàn)假陽性。 應(yīng) 用場所 試劑盒法適合于實(shí)際應(yīng)用現(xiàn)場測定及快速檢測 ,對于食品衛(wèi)生監(jiān)督部門來說是一種快速現(xiàn)場檢測抗生素殘留的有效手段，同時作為企業(yè)該方法亦可成為質(zhì)量控制的質(zhì)檢手段。在檢測時間方面，采用試劑盒法較試管檢測的 TTC法和紙片法鑒定平皿要節(jié)省時間 [17]。三種方法檢測結(jié)果差異顯著。 紙片法測得結(jié)果： 有抑菌圈的奶樣有奶樣 2和 13，大約 15mm的抑菌圈，為陽性，有抗生素存在； 奶樣 8和 10有大約 13mm左右 的小圈 ,為可疑對象； 其他奶樣均無抑菌圈存在，為陰性說明無抗生素存在。 ＋ /－ 11 0 － 12 0 － 13 15177。樣品紙片如有明顯的抑菌圈，直徑 14 mm，表示確診有抑菌物質(zhì)，為陽性，并結(jié)合青霉素 濾片的抑菌情況來確證是否為青霉素所致 (如 ≤14 mm則為陰性 )。 實(shí)驗(yàn)表明試劑盒沒有問題，對照實(shí)驗(yàn)成功，抗生素抑制微生物生長。綠 黃色或者黃色表示抗生素不存在（陰性），藍(lán) 紫色表示抗生素存在（陽性）。對照實(shí)驗(yàn)成功。與此相反 ，被檢牛奶中如果沒有抗生素殘留， 加入的嗜熱鏈球菌則可以進(jìn)行增殖， TTC被還原而顯紅色，呈陰性結(jié)果。翻轉(zhuǎn)平皿，于 (64177。加青霉素酶 mL黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 14 于 5 mL試驗(yàn)中混勻并用濾片浸漬 ，把濾片輕輕接觸樣品容器內(nèi)壁以滴干多余牛乳，立即把各個濾片放在瓊脂表面，輕輕壓迫以很好接觸。翻轉(zhuǎn)平皿，于 (64177。2)℃ 培養(yǎng) 3～ 4 h，以青霉素陽性對照得到可見的抑菌圈為宜。2)℃ 培養(yǎng) 48～ 72 h。1 ℃ 水浴30min 不顯色 紅 色 色 顯色者 抗生素陰性 報 告 報 告 抗生素陰性 不顯色者 抗生素陽性 黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 13 （ 4）樣品保溫檢測：將被檢樣品加入到各個反應(yīng)管中后，全部插入到已達(dá)到 64℃ 的恒溫器樣品孔內(nèi)，開始計(jì)時間。 （ 3）被檢奶樣的吸?。喝ヒ恢酉搭^插到取樣注射器上，將塞柱緩慢抽回吸取被檢奶樣 ，全部移入被檢反應(yīng)管中。 黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 12 操作順序如下圖： 圖 21 TTC法操作順序 試劑盒法 (1)準(zhǔn)備工作：確定被檢樣品和數(shù)量后，開啟恒溫器電源加熱升溫，待恒溫器溫度上升至 64℃ （ 177。 （ 3）結(jié)果觀察 乳中有抗生素存在時，加入指示劑 TTC后牛 乳 不顯色，即抗生素陽性；相反，如果沒有抗生素存在，則加入 TTC后顯紅色，即抗生素陰性。 （ 1）取待檢乳液 9ml，置滅菌試管中， 80℃ 水浴加熱 5 min。 菌液制備 將凍干保存的嗜熱性乳酸鏈球菌接種于滅菌脫脂乳培養(yǎng)基中， 36177。 紙片法 : 青霉素標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確稱取青霉素 G鉀標(biāo)準(zhǔn)品 20mg，用磷酸鹽緩沖液溶解，制備為 1 000g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置 4℃ 冰箱中保存。如遇溶液變?yōu)榫G色或淡褐色，則不能再用。 （ 1）脫脂乳：經(jīng) 113℃ 、 20min滅菌 （ 2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基： a 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方： 牛肉膏 蛋白胨 NaCL 水 1000ml pH ～ b 溶液或試劑：牛肉膏，蛋白胨， Nacl，瓊脂， 1mol／ L NaOH， 1mol／ LHCL。本實(shí)驗(yàn)通過國標(biāo) TTC法和試劑盒法、紙片法檢測結(jié)果的比較為抗生素殘留快速檢測方法的補(bǔ)充提供理論依據(jù)。 牛奶中抗生素殘留問題日益受到社會各界的重視。 本實(shí)驗(yàn)研究的目的與意義 牛奶是營養(yǎng)最全面的營養(yǎng)品 。Snap 快速檢測法耗時 9min，結(jié)果重現(xiàn)性好， 操作簡便，但實(shí)驗(yàn)成本較高。 Delvotest MCS 是 DelvotestSP 的微孔板格式，但營養(yǎng)試劑已直接加入瓊脂內(nèi)，使用時無需再添加營養(yǎng)藥片，操作更方便，但保質(zhì)期短，適合于大型檢測中心使用。 DelvotestP 已經(jīng)在全世界通用，可以檢測到。目前 GCM S 應(yīng)用較多，而 LCM S 是除 GCM S 之外，又一種集高效分離和多組分定性、定量于一體的系統(tǒng)。它一 般集分離、定量和定性于一體，