【正文】 .......................................4 載體的選擇..................................................4 質粒人工構建的目的.................................................4 MRP1 的研究進展......................................................4 第二章 實驗材料與方法.....................................................5 實驗材料.............................................................5 宿主菌.............................................................5 載體通用引物................................................5 主要儀器..........................................................5 試驗方法.........................................................5 shRNA 的設計與退火..................................................5 合成干涉片段的退火..........................................6 重組載體的構建..............................................6 菌落PCR初步篩選陽性重組子..................................7 測序鑒定重組載體...............................................7 第三章 結果與分析.........................................................8 質粒經HindⅢ和BamHI雙酶切后膠回收結果...........................8 質粒經HindⅢ和BamHI雙酶切后結果.............................8 目的片段的回收................................................8 重組質粒的菌落PCR...................................................8 重組質粒大量提取......................................................8 重組質粒測序結果.................................................8 參考文獻..................................................................9摘 要癌癥嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)現的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達的技術，如能通過RNAi技術沉默MDR1基因，逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎。 DH5α后大量提取重組質粒，經菌落 PCR和 DNA測序分析檢測重組載體構建結果。RNAi有望成為分析人類基因組功能的有力工具，在腫瘤病因、免疫機制及治療等方面的研究上有廣闊的發(fā)展前景。 RNAi的特點RNAi具有高效性，也就是說與細胞內的mRNA的量相比，注入細胞內的siRNA的量要少得多。 siRNA的設計原則RNAi 作用的成功與否，關鍵在于siRNA序列的結構，不同結構的siRNA序列沉默基因的效率差別很大，2001年，Elbashir S M等[應用化學合成法合成了siRNA，并發(fā)現可以誘導哺乳動物發(fā)生RNAi，他們進而據此提出了siRNA 設計方法：1)從起始密碼下游50~100nt開始搜索siRNA以避免出現于5′或3′端的UTRs 的蛋白結合位點，；2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果沒有相應序列，可以選擇5′AA(N21)或5′NA(N21)；3)G/C含量在32%~79%之間[16]； 4)要確定siRNA對靶基因的特異性，可以利用Blast軟件在基因組中進行比對，；5)設置在基因組中無對應序列的siRNA的對照siRNA。載體具有以下的功能：（1）運送外源基因高效轉入受體細胞；（2）為外源基因提供復制能力或整合能力；（3）為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。質粒載體是為適應實驗室操作在天然質粒的基礎上人工構建的。第2章 實驗材料與方法 實驗材料 宿主菌 DH5α：為感受態(tài)宿主菌由北京鼎國生物技術有限責任公司提供。shRNA的 5DNA模板由上海生工合成，單鏈干涉片段退火后形成雙鏈。（2）實驗前預先配制溶液Ⅱ，溶菌酶。（3）加預冷的溶液Ⅰ50ml于每離心桶，混勻，洗滌沉淀。（5）加40ml新配制的溶液Ⅱ，以使菌體破碎，釋放質粒DNA等內容物。（7）將上清液在4℃下以10000r/min離心10min，然后將上清液經8層紗布過濾至新離心桶中。（10）倒上清于新的離心桶中，加30ml異丙醇，劇烈震蕩，靜置沉淀15min，在4℃下以10000r/min離心15min。（12）用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下以10000r/min離心5min，棄去乙醇，離心桶敞口倒置于紙巾上，使乙醇揮發(fā)殆盡。以使RNA徹底分解。（17）小心吸上清與另一離心管中，加2倍體積的預冷無水乙醇，（3mol，），冰上沉淀20min，4℃下10000r/min離心15min，使DNA沉淀出來。PCR反應條件為：94℃預變性2分鐘；94℃ 變性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，共35個循環(huán)；72℃ 延伸1分鐘，4℃保存，％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。第3章 結果與分析 質粒經HindⅢ和BamHI雙酶切后膠回收結果 質粒經HindⅢ和BamHI雙酶切后結果Ⅲ和BamHI雙酶切，結果顯示單酶切產物大小約為6200bp，雙酶切產物略小于單酶切產物，與預期結果相符。重組質粒大提并稀釋50倍以后在紫外分光光度儀Genespec上測其OD值?；蚣夹g將可能給人類在疾病防治、健康保健直至延年益壽方面帶來的革命性變化勾起了人們對未來美好生活的無限憧憬。由植物病毒分子生物學的發(fā)展,植物抗病基因工程也也已全面展開。由于植物生理學家、遺傳學家和分子生物學家協(xié)同作戰(zhàn),耐澇、耐鹽堿、耐旱和耐冷的轉基因作物新品種(系)也已獲得成功。隨著生活水平的提高,人們越來越關注口味、口感、營養(yǎng)成分、欣賞價值等品質性狀?；蚬こ趟幬镏饕毎蜃印⒖贵w、疫苗、激素和寡核 淮陰工學院生物課程論文第 2 頁共 7 頁甘酸藥物等。目前,應用基因工程研制的艾病疫苗已完成中試,并進入臨床驗證階段。此項基因學研究成果在國際治肝領域中,是繼干擾素等藥物之后的一項具有革命性轉變的重大醫(yī)學成果。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢桿菌、且表達成功?；蚬こ檀嬖诘臓幾h目前普遍的看法是，人類在基因技術如何影響人類社會傳統(tǒng)倫理道德方面的研究遠遠落后于對基因技術本身的研究。但是克隆人以及一些武器發(fā)展方面的問題，就要靠社會的約束和管理，要靠人類自己的抉擇，畢竟科學都是有正反兩面性的。印度有一種訥木樹，一家西方公司從其中分離出有效成份，申請和獲得多項訥木提取液生產工藝的專利，這種被生物資源地稱之為“生物剽竊”的做法是否妥當。比如消化木質素的遺傳工程酶對造紙業(yè)有極大的價值，可一旦這種細菌進入森林，則導致森林毀滅。 遺傳工程食品會不會危及人類健康致敏性生物基因的遺傳工程食品會引發(fā)人群嚴重變態(tài)反應。對于這些爭議，作為科技界，應該在保持清醒頭腦和良知的同時做出認真選擇，讓基因工程趨利避害，真正為社會和人類服務。 營養(yǎng)問題科學家們認為外來基因會以一種人們目前還不甚了解的方式破壞食物中的營養(yǎng)成分。在一次實驗室研究中，一種蝴蝶的幼蟲在吃了含桿菌基因的馬利筋屬植物的花粉之后，產生了死亡或不正常發(fā)育的現象，這引起了生態(tài)學家們的另一種擔心，那些不在改良范圍之內的其它物種有可能成為改良物種的受害者。所以,我們要在抓住機遇,大力發(fā)展基因工程技術的同時,需要嚴格管理,充分重視轉基因生物的安全性。利用基因工程技術改變基因組構成而形成的動植物、微生物及其產品被稱為轉基因生物產品。人們在服用了這種改良食物后，食物會在人體內將抗藥性基因傳給致病的細菌，使人體產生抗藥性。 毒性問題一些研究學者認為，對于基因的人工提煉和添加，可能在達到某些人們想達到的效果的同時，也增加和積聚了食物中原有的微量毒素。人類很久以來所追求和艱難保存的個人和公共的安全，可能在追求完美自身的遺傳改造過程中不可逆地喪失。 遺傳工程使動物受難在科學實驗中插入突變基因的小鼠，常常發(fā)生沒有后腿、面裂、腦缺，世界動物 淮陰工學院生物課程論文保護協(xié)會對這些實驗一直都持