20xx年醫(yī)學(xué)專題—免疫細(xì)胞的分離與檢測(文件)
【正文】 發(fā)生的主動(zhǔd242。 壞死（necrosis）：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。 凋亡是細(xì)胞對環(huán)境的生理性病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程。,細(xì)胞凋亡(diāo w225。,細(xì)胞凋亡(diāo w225。bāo)皺縮 （2）染色質(zhì)邊集 （3）凋亡小體出現(xiàn),第六十一頁，共七十五頁。nɡ)的檢測方法,形態(tài)觀察法：凋亡的細(xì)胞皺縮，質(zhì)膜完整，胞漿致密，細(xì)胞器密集，不同程度退變；核染色質(zhì)致密，形成形狀不一，大小不等的團(tuán)塊邊集于核膜處，進(jìn)而(j236。 生化檢測法： ①胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高。 ⑤Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和鈣蛋白酶（Calpain）活性升高。i)觀察法,（1）普通光鏡檢測 HE染色 甲基綠派諾寧染色：細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動死亡過程，需要有細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的激活，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常有mRNA表達(dá)的增強(qiáng)。,二、細(xì)胞凋亡(diāo w225。)著染，而細(xì)胞質(zhì)無染色。,第六十六頁，共七十五頁。)成塊，出現(xiàn)染色質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列的核邊集現(xiàn)象。)檢測法,（1）凝膠電泳法： （2）原位末端標(biāo)記法 （3）二苯胺(běn 224。典型的細(xì)胞凋亡，在核內(nèi)形成大量200bp大小及其倍體的核苷酸片段，而非典型的凋亡細(xì)胞，由于核內(nèi)的DNA降解不完全，僅形成300~50kb的DNA大片。,凝膠電泳特點 (1) 本方法不能檢測(jiǎn c232。,（2）原位末端標(biāo)記法（TUNEL）,原理：利用標(biāo)記的dUTP，在TdT作用下結(jié)合DNA斷片的3’末端羥基，顯示斷鏈DNA，提示凋亡 方法：制備組織(zǔzhī)切片 標(biāo)記物結(jié)合 標(biāo)記物顯色 鏡檢,第七十一頁，共七十五頁。,（3）二苯胺(běn 224。nɡ)百分率 =,上清液OD值,上清液OD值+沉淀(ch233。ir243。細(xì)胞在內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的主動死亡過程，也稱程序性死亡。 ɡ249。,。上清液OD值。 w224。主要組成成分為MACS微珠、MACS分選柱和MACS分選器。n)OD值,第七十四頁，共七十五頁。 方法：裂解細(xì)胞 13000g超速離心 分別提取DNA 使DNA顯色，測定,第七十三頁，共七十五頁。)者為陽性細(xì)胞。 (2) 不能提供細(xì)胞發(fā)生凋亡所處的組織位置和細(xì)胞分化狀態(tài)。 方法：提取(t237。)方法,第六十八頁，共七十五頁。,第六十七頁，共七十五頁。鏡下可見凋亡細(xì)胞體積變小、細(xì)胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞核變小、染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)(n237。,（2）熒光顯微鏡檢測—溴化丙錠（PI）染色(rǎns232。,甲基綠派諾寧染色：光學(xué)顯微鏡下凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞固縮：其中凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色(lǜ s232。根據(jù)(gēnj249。,形態(tài)(x237。 ③質(zhì)膜通透性增高。r)胞核裂解；胞漿發(fā)生芽突。bāo)凋亡,第六十二頁，共七十五頁。,細(xì)胞(x236。g242。,第五十七頁，共七十五頁。ir243。,第五十六頁，共七十五頁。bāo)凋亡的概念 細(xì)胞凋亡的原理 細(xì)胞凋亡的特點,第五十五頁，共七十五頁。bāo)凋亡測定,一、細(xì)胞(x236。)25min。,NBT還原(hu225。,NBT還原(hu225。)百分率 =,吞有顆粒(kēl236。,細(xì)胞吞噬(tūnsh236。)空斑試驗,第四十七頁，共七十五頁。,直接(zh237。,直接溶血空斑試驗(sh236。ng)靶細(xì)胞釋放出來的放射性DNA）。 標(biāo)記的靶細(xì)胞：活淋巴細(xì)胞（96%以上）加入H3Tdr孵育2小時/每30min振搖洗3次配成2106/ml懸液。用3HTdR摻入法，靶細(xì)胞為YAC1細(xì)胞株（小鼠淋巴瘤細(xì)胞系）。ng)不需要抗體、補(bǔ)體的參加，所殺傷靶細(xì)胞通常指腫瘤細(xì)胞和病毒感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。ng)率（%） 2(上清cpm—本底cpm) 100% (上清cpm本底cpm)＋( 沉淀cpm本底cpm) 51Cr 特異釋放率（%） 試驗釋放率—自然釋放率 100% 最大釋放率－自然釋放率,第四十一頁，共七十五頁。,（3）結(jié)果判斷(p224。 自然釋放管：標(biāo)記的靶細(xì)胞0.1ml ，加完全培養(yǎng)基1.9
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