【正文】 用常規(guī)的組織學(xué)染色方法，如 Giemsa染色、 HE 染色或 Mayer蘇木素染色。 DAPI是含有特定 AT序列 DNA的一種嵌入劑，能像 Hoechst dye一樣粘附在 DNA雙螺旋的小溝區(qū)。 （ 二 ） 凋亡細(xì)胞的電鏡觀察 采用電鏡的常規(guī)方法固定 、 包埋和制片 。 （ 三 ） 凋亡細(xì)胞的原位末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法 （ in situ terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTPdigoxigenin (biotin) nick endlabeling, TUNEL） 細(xì)胞凋亡的多步驟機(jī)制作用的最終環(huán)節(jié)是細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致核染色質(zhì) DNA雙鏈的斷裂 。 2. 標(biāo)記方法 熒光顯色的標(biāo)記法 ： ?生物素結(jié)合的 dUTP（ biotindUTP）標(biāo)記法 ； ?地高辛結(jié)合的 dUTP（ digoxigenindUTP） 標(biāo)記法 ； ?溴 dUTP（ bromo dUTP） 標(biāo)記法 ， 一般用結(jié)合了 avidin的異硫氰酸熒光素 （ fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC） 與生物素化的二抗或標(biāo)記了 FITC的抗地高辛抗體或抗 BrdUrd抗體作為發(fā)色源 ， 凋亡的細(xì)胞核呈綠色熒光 。 其余細(xì)胞制片均需水化后 ， 用 PBS洗滌三次 ， 每次 10min， 然后進(jìn)行標(biāo)記 。 按每張切片取 TdT和 DIGdUTP各 1μl， 加入 18μl標(biāo)記緩沖液中 ， 混勻 。 （ 如果要封閉內(nèi)源性生物素 ， 就在 此步進(jìn)行 ） （ 7） 加封閉液 50μl/片 ， 室溫下 30min， 甩掉封閉液 ， 不洗 。 TBS洗滌 5min 4次 。OH+dUTP HRP: horseradish peroxidase SABC TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase DIG: digoxigenin Immunostaining of Fas and Fas L bined with in situ TUNEL assay Fas, EnVison Fas, EnVison Fas L, EnVison Fas L, EnVison 400 400 400 400 （ 四 ） DNA凝膠電泳 1. 檢測原理 細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死， DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子量 DNA片斷增加，高分子 DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn) DNA片斷。 磷脂結(jié)合蛋白 V（ Annexin V） 是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白 ， 與 PS具有高度的結(jié)合力 。 2. 結(jié)果判斷 正常活細(xì)胞 DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀（ Ladder)條帶；壞死細(xì)胞 DNA電泳類似血抹片時(shí)的連續(xù)性條帶。 （ 11） 蘇木素輕度復(fù)染 ， 水洗 ， 脫水 、 透明 、 封片 ， 鏡檢 觀察 ， 棕色細(xì)胞核為陽性 。 （ 9） 用封閉液 1： 100稀釋 SABC：取 1ml封閉液加 SABC 10μl， 混勻后加至切片 。 置切片于保濕合中 ， 37℃ 標(biāo)記 2h， 如果陽性結(jié)果不強(qiáng) ， 可采用 4℃ 標(biāo)記過夜 ， 再加 37℃ 標(biāo)記 2h。 （ 4） 滴加用 TBS以 1： 100新鮮稀釋的 proteinase K， 37℃ 消化 515min， TBS洗滌 2min 3次 。 3． 操作步驟 （ 以地高辛結(jié)合的 dUTP標(biāo)記法為例 ） (1)試劑 ① 5 濃度的 TdT反應(yīng)緩沖液 ， 含有以下成分 1 mol/L potassium (or sodium) cacodylate 125 mol/L TrisHCl (4℃ , pH ) mg/ml bovine serum albumin (BSA) 10 mmol/L cobalt chloride ② digoxigenindUTP ③ TdT酶 ④ proteinase K ⑤ 生物素化的抗地高辛抗體 ⑥ SABC試劑 ⑦ DAB （ 1） 標(biāo)本的制備 ① 經(jīng)福爾馬林固定的常規(guī)組織石蠟切片； ② 冰凍切片 ， 4%多聚甲醛 4℃ 下固定 1030min， 80%乙醇后固定 2h以上 （ 或在 80%乙醇內(nèi)保存于 20℃ 冰箱待用 ） ； ③ 各種臨床細(xì)胞涂片 、 刮片 、 脫落細(xì)胞制片及 培養(yǎng)細(xì)胞的制片等 ， 用 14%多聚甲醛 4℃ 下固定 1530min， 然后在 80%乙醇內(nèi)后固定 2h以上 。 1． 試劑盒及標(biāo)記法種類 凋亡細(xì)胞檢測試劑盒： Phoenix公司 （ San Diego， USA） Boehringer Mannheim 公司 （ Indianapolis， USA） Intergen 公司 （ Purchase， USA） Oncor公司 （ Gaithersburg， USA） 只要按試劑盒中所提供的說明書進(jìn)行操作 ， 均可獲得滿意的結(jié)果 。 透射電鏡下 ， 凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮 、 核膜消失 ， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張 ， 而細(xì)胞器如線粒體等形態(tài)仍保持良好 ， 可見被膜結(jié)構(gòu)包繞的細(xì)胞器 ， 即凋亡小體 。 ? PI（ propidium iodide, 碘化丙啶） 。 ? DAPI（ 4’ , 6 diamidino 2phenylindole。 離心后涂片 ， 稍經(jīng)空氣中干燥后 ， 迅速用 1%多聚甲醛4℃ 下固定 1530min， 然后轉(zhuǎn)入 80%乙醇后固定 12h， 保存于 20℃ 待用 。 6. 熒光染色后一般在 1h內(nèi)完成觀察 ， 或于 4℃ 保存 4h， 時(shí)間過長 ， 可能會使熒光提前衰退 。 3. 免疫熒光在封片時(shí)常使用專用封片劑或甘油 （ PBS 1：1） 。 方法： 直接法、間接法 直接法： 將兩種或三種來自不同種屬 ， 并標(biāo)記了可發(fā)出不同顏色熒光的抗體 （ 如抗 A、 抗 B、抗 C） 以適當(dāng)比例混合 ， 加在標(biāo)本上孵育后 ，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體 ， 抗 A抗體用發(fā)黃綠色熒光素標(biāo)記 ， 抗 B抗體用發(fā)紅色熒光素標(biāo)記 ， 抗 C抗體用發(fā)藍(lán)色熒光素標(biāo)記明確顯示兩種或三種抗原的定位 。 350，顯示藍(lán)色熒光。 555，顯示紅色熒光； 吸收光譜峰值： 555nm ，激發(fā)光譜峰值： 565nm 。 二、間接法 是直接法的重要改進(jìn) ， 先用特異性第一抗體抗體與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng) ， 隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體 ， 再用標(biāo)記熒光的第二抗體與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合 ， 形成 抗原 抗體 熒光抗體 的復(fù)合物 。 免疫熒光染色及多重染色技術(shù) Single and multiple immunofluorescent labeling ◆ 原理： 是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗體或抗原標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。 （ 三 ） 活性滅活法 是一種新建立的方法 ， 主要是根據(jù)通過在溶液中加熱滅活第一次染色中的抗原 、 抗體和酶活性后再進(jìn)行第二種染色的原理而設(shè)計(jì)的 。 二 、 非洗脫法 （ 一 ） 直接法 如果采用不同種酶標(biāo)記在不同的第一抗體上 ， 則只能用順序染色法 。 3. 洗脫法的一般步驟 ? 按常規(guī)做第一種免疫組化染色 ， 可選用 HRP為標(biāo)記物 ，顯色底物為 4氯萘酚 ， 陽性部位反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)色 。在完成第一種免疫組化染色后 ， 將抗原抗體復(fù)合物洗脫 ， 再做第二種染色 。 光鏡下通過標(biāo)記物或其反應(yīng)生成物的顏色來標(biāo)記不同的抗原成分 ， 以幫助研究者了解含有這些不同抗原的各類細(xì)胞 、 組織之間的相互關(guān)系 。 現(xiàn)代國際上發(fā)表文章 ， 在免疫組化染色的同時(shí) ， 還須有 Western blotting做相應(yīng)蛋白質(zhì)檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以證實(shí) 。 六 、 自身對照 用同一組織切片上與待檢抗原無關(guān)的其它結(jié)構(gòu)做對照 。 四 、 替代對照 用與第一抗體來源的同一動物免疫前血清 ， 如第一抗體用的是兔抗人 GFAP的 IgG抗體 ， 對照中用非免疫性的正常兔 IgG血清來替代一抗 ， 以相同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行對照染色 。 所以若預(yù)期染色結(jié)果是陰性時(shí) ， 就必須設(shè)陽性對照 。 由于免疫組織化學(xué)染色中影響抗原 、 抗體和免疫反應(yīng)的因素很多 ， 因此對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的評價(jià)必須設(shè)置對照組才能做出正確的判斷 。 上述所提及的各種顯色液目前均有以 試劑盒 形式出售 ， 只要按說明操作即可 ， 但價(jià)格較貴 。 該顯色液作用后 ， 陽性部分為紅色 ， 如以蘇木素或亮綠復(fù)染核后 ， 效果更佳 ， 但終產(chǎn)物溶于酒精和水 ， 故需用甘油封固 。 將洗滌后的切片浸入顯色液中 51020min， 應(yīng)閉光下反應(yīng) ， 并隨時(shí)在顯微鏡下觀察結(jié)果 ， 隨時(shí)終止反應(yīng) ， 也可使用商品化的即用型 DAB。 ? 染色步驟簡便 ， 在一抗反應(yīng)后 ， 切片經(jīng) PBS洗滌后即可加入 EnVison?系統(tǒng)試劑 ， 再經(jīng) PBS洗滌后 ， 可進(jìn)行顯色 。 這種復(fù)合物中至少存在一個(gè)尚未被生物素占據(jù)的親和素結(jié)合位點(diǎn) ， 可以和各種生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合 。 Biotinylated second antibody PO PO PO PO Antigen Biotin Avidin HRP Primary antibody Illustration of ABC method Avidinbiotinperoxidase plex Ag Ag Biotin Streptavidin Enzyme: HRP or AP Primary antibody Biotinylated secondary antibody Illustration of SP method SP plex ? SABC 法的染色原理及特點(diǎn) (1) 基本原理 鏈酶親和素是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì) ，分子量 60kD， 不含糖鏈 ， 等電點(diǎn) PI 。 根據(jù)上述這些抗生物素 生物素的反應(yīng)原理和特性 ， 1981年許世明設(shè)計(jì)出了免疫組織化學(xué)染色的 ABC法 （ avidinbiotin peroxidase plex method， ABC ） ， 并已制成了商品化的試劑盒 。 研究者根據(jù)這兩種物質(zhì)的特點(diǎn) ， 提出了卵白素 生物素免疫染色系統(tǒng) 。 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn) ， 在雞蛋白中含有一種堿性蛋白 ， 分子量為 68 kD， 屬于糖蛋白 ， 當(dāng)時(shí)命名為 卵白素（ avidin） 。 二抗分濃縮型和即用型兩種 。 如果待檢的抗原量很少 ， 而增加一抗的濃度又能引起較明顯的背景染色 ， 可增加一抗的稀釋倍數(shù) ， 將切片放在保濕盒中置于 4℃ 冰箱內(nèi)過夜孵育 ， 可達(dá)到滿意的效果 。 一抗稀釋滴度的評價(jià) （摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)可以稀釋度跨度大一些試） 切片編號 slide 1 slide 2 slide 3 slide 4 slide 5 抗體稀釋度 1: 50 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 特異性染色 + + + + + + + + + + + + + + + 背景染色 + + + + + – – ③ 一抗體的稀釋 一般稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體相同 ， 即 PBS pH ， 為進(jìn)一步保證減少背景染色 ， 用于稀釋一抗的 PBS中也應(yīng)加入制備二抗的同種動物的非免疫正常血清 ， 有條件的還可加入 BSA， 兩者的濃度在 125% 即可 。 ? 國外生產(chǎn)的一抗一般濃度都是 100200?g/ml， 但國內(nèi)各經(jīng)銷商將進(jìn)口的原裝抗體又進(jìn)行了分裝 ， 如分成 ，也經(jīng)銷 1ml/瓶抗體 ， 價(jià)格各不相同 。 ① 一抗的種屬來源 一抗可來源于各種種屬的動物 ， 常見是來自家兔 、 山羊或小鼠 ， 偶見來自馬 。 ? 非免疫血清的稀釋度 1:5~1:20， 還可加入 BSA (bovine serum albumin) 使稀釋后的非