《遺傳工程動物》ppt課件(文件)
【正文】 的制備 （一）原理 將 ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后，用經(jīng)過改造的 外源基因打靶載體導(dǎo)入 ES細(xì)胞內(nèi) ，在細(xì)胞水平 用正負(fù)篩選法 篩選外源基因定點(diǎn)整合的 ES細(xì)胞株。 25 1. 基因打靶載體的構(gòu)建 1）載體的兩端有同源臂； 2）外源基因； 3）要有正負(fù)篩選基因 正篩選： Neor基因（用G418篩選，殺死未整合的細(xì)胞） 負(fù)篩選： tk基因（用Ganc篩選，殺死隨機(jī)整合的細(xì)胞） tk tk 5’同源臂 3’同源臂 Neor 圖 112 打靶載體的構(gòu)建示意圖 26 同源臂 同源臂 外源基因 Tk基因 定點(diǎn)整合 隨機(jī)插入 ES細(xì)胞 正常細(xì)胞 G418 + Ganc培養(yǎng)液 ES細(xì)胞內(nèi) 27 正負(fù)篩選出來的 ES細(xì)胞是否是我們想要的定點(diǎn)整合細(xì)胞，需要用分子生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)到囊胚階段后，將 ES細(xì)胞 注射到囊胚內(nèi)，經(jīng)短暫體外培養(yǎng)后將它移植于假孕第 2天小鼠的子宮中。 32 傳統(tǒng)技術(shù) 最新四倍體補(bǔ)償技術(shù) 2細(xì)胞胚胎 四倍體胚胎 發(fā)育到囊胚 囊胚內(nèi)注入突變 ES細(xì)胞 胚胎移植 ES細(xì)胞遺傳背景雜合子 電融合 確定交配 囊胚內(nèi)注入突變 ES細(xì)胞 胚胎移植 ES細(xì)胞和囊胚來源的嵌合體 嵌合體 野生型 雜合子 33 ES細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) ?能在細(xì)胞水平進(jìn)行篩選 。 ?ES介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因需要經(jīng)過嵌合體這一中間步驟 。 35 基因敲除小鼠由于在 ES細(xì)胞內(nèi)用同源重組方法一般僅滅活一個位點(diǎn)，根據(jù)孟德爾的遺傳法則，同源染色體的一對等位基因中一個位點(diǎn)發(fā)生滅活，其基因功能由等位基因的另一個位點(diǎn)代替，從而不表現(xiàn)任何突變的形狀。經(jīng)過 6代回交后，其遺傳背景將是C57BL/6了。 在下列情況下必須以雜合子狀態(tài)維持：①所研究的靶基因突變是致死的，純合子可能在胚胎期或出生后早期死亡，或性成熟前死亡；②純合子小鼠不育。 Cbfa1可于轉(zhuǎn)錄水平使 MSCs定向分化為成骨細(xì)胞，也可使軟骨細(xì)胞肥大化，進(jìn)而促進(jìn)軟骨內(nèi)化骨 . ? 小鼠成骨細(xì)胞特異過表達(dá) Cbfa1導(dǎo)致骨基質(zhì)形成減少，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，表明 Cbfa1在骨發(fā)育后的骨形成過程中也起作用。骨保護(hù)素缺失小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥，骨密度減低，破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，骨轉(zhuǎn)換率加快， 45 RigI基因剔除導(dǎo)致小鼠抗細(xì)菌免疫功能障礙 Genotype wt +/ / Sex ♂ ♀ total ♂ ♀ total ♂ ♀ total n 49 48 97 39 51 90 39 50 89 Eye infection 0 0 0 0 0 0 10 15 25 % 0 0 0 0 0 0 30 Skin infection 1 0 1 0 1 1 4 3 7 % 2 0 1 0 6 RIGⅠ 基因與 B細(xì)胞發(fā)育有關(guān)， RIGⅠ 基因缺失小鼠存在免疫缺陷，表現(xiàn)為骨髓和脾臟中 B細(xì)胞的發(fā)育存在成熟障礙，機(jī)體 IgG3抗體的產(chǎn)生或與此有關(guān)的類別轉(zhuǎn)換出現(xiàn)問題，導(dǎo)致了該類小鼠對細(xì)菌易感，從而證明 RIGⅠ 基因在小鼠的免疫反應(yīng)中具有不可或缺的重要作用。 在 DNA構(gòu)件上的不同點(diǎn) 、正常雄鼠、受體（假孕 )雌鼠和結(jié)扎雄鼠在遺傳工程小鼠制作中的作用。 。 。該基因突變使小鼠發(fā)生雄性不育、睪丸萎縮、精子發(fā)生障礙。118(3):643648. PLAG1編碼一種發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 ,體外研究表明其異位表達(dá)往唾液腺多形性腺瘤的發(fā)生起重要作用。 應(yīng)用條件性基因打靶技術(shù)是避免致死性突變的最有效途徑。 36 二、遺傳工程小鼠品系的維持 遺傳工程小鼠品系是以半（雜）合子狀態(tài)還是以純合子狀態(tài)維持好呢？ 從理論上講以純合子狀態(tài)飼養(yǎng)繁殖最理想，因?yàn)榻⒘思兒献悠废稻湍芊€(wěn)定遺傳，不必每一代都進(jìn)行基因型檢測。純合子小鼠即是我們所希望得到的基因敲除小鼠。 轉(zhuǎn)基因小鼠導(dǎo)入的外源基因可以在半合子狀態(tài)表達(dá)，但表達(dá)的程度因整合位點(diǎn)的不同有所差異。 缺點(diǎn) ?ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件苛刻 、 技術(shù)要求高 ， 成本大 。 其基本原
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