qpcr實驗操作流程(文件)
【正文】 先在記錄本上編排好上機的樣品排放順序。3．cDNA用滅菌純水稀釋適當?shù)臐舛?，一般?:20稀釋，如遇到基因表達低的樣品，則適當降低稀釋比例至1:10或1:5。五．上機： 先開電腦，進入Windows 界面。 點擊Start鍵，開始運行程序。（同一個客戶的三次重復實驗，則只需保存其中一次重復的反應管即可，其余可丟棄）6。 在7500軟件上標記好每個反應孔的樣品名稱及檢測基因的名稱，分類保存好結(jié)果文件。 打開7500軟件，選擇“新建”，在“Template”下拉菜單中選擇“60”或“65”（普通基因檢測為“60”，MicroRNA檢測為“65”） 打開樣品架，放入八連管，關上樣品架，并在軟件上選擇已放反應管的孔位，剔除無反應管的孔位。加樣完畢，蓋好八連管蓋，并在八連管蓋最上沿的邊上標記好112的順序（不可將標記寫在反應管的蓋子上，八連管蓋避免裸手觸摸中間透明的熒光采集區(qū)域，且保證每孔均蓋緊，否則影響重復性或可能出現(xiàn)熔解曲線峰漂移。體系分裝會有損失。得到結(jié)果后，首先根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性，選擇標準為：單峰且峰形偏窄、水對照無明顯引物二聚體熔解曲線峰。l181。隨后立即置于冰上，以防止RNA復性再次恢復二級結(jié)構(gòu)；3） 在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mM dNTP (promega) RNase inhibitor (promega) U6逆轉(zhuǎn)錄引物5x buffer MMLV (promega) 181。2. microRNA：使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法，原理如下圖：1） 在去RNase的PCR管中配置以下溶
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