染色體顯帶原理與技術(shù)(文件)
【正文】 pH值為 11是顯帶成功的關(guān)鍵。 實(shí)驗(yàn)用品 光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、立式染色缸、 人外周血淋巴細(xì)胞染色體玻片標(biāo)本（ 75℃ 中烤片 3小 時(shí)，未經(jīng)染色）。 顯帶觀察 帶型與 G顯帶標(biāo)本一致，熒光顯微鏡下觀察染色體上呈現(xiàn)出的亮帶就相當(dāng)于 G顯帶染色體標(biāo)本的深帶。 實(shí)驗(yàn)原理 人類的近端著絲粒染色體 (即 1 1 121和 22號染色體 )的副縊痕處與核仁形成有關(guān)，故稱核仁形成區(qū)（ nucleolusanizing region，NOR），它是中期染色體上的明顯結(jié)構(gòu)之一。 由于具有轉(zhuǎn)錄活性的 rRNA基因 (rDNA)往往伴有豐富的酸性蛋白質(zhì) ,該類蛋白質(zhì)含有巰基 （ SH） 和二硫鍵 （ SS） ,能使 AgNO3中的 Ag+還原成 Ag顆粒 ,因此有轉(zhuǎn)錄活性的核仁形成區(qū)常被鍍上銀顆粒而呈現(xiàn)黑色 ,沒有轉(zhuǎn)錄活性的 NOR則不著色 。 因此 ， 銀染近端著絲染色體聯(lián)合 （ Agstained acrocentric association ,AgAA） 可以作為準(zhǔn)確地判斷人體細(xì)胞是否存在近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合的客觀標(biāo)準(zhǔn) 。 實(shí)驗(yàn)方法 設(shè)一 60℃ 水浴箱；另置 Giemsa染液缸于 37℃ 水浴箱 。 用吸管將 AgNO3溶液慢慢滴于玻片紙上 ， 直至擦鏡紙呈棕黃色 （ 黑色 ） 為止 ， 一般 5ml能滴兩張玻片 。一般染色 5分鐘。 注意事項(xiàng)： AgNO3工作液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，并注意避光。 滴片時(shí)染色體標(biāo)本片一定要平置，以使染液均勻分布在標(biāo)本上，使標(biāo)本著色均勻。 T顯帶 T顯帶是 R顯帶的亞類，因?yàn)樘禺惖刂? 在端粒而稱為 T顯帶。 它的功能包括確保染色體末端的正常復(fù)制；防止斷裂的 DNA與染色體末端的重組 。 T顯帶技術(shù)專門顯示染色體端粒 ，可用于分析染色體端粒有無缺失 、 易位等畸變 。 實(shí)驗(yàn)方法 1. 制片：常規(guī)外周血法制備的標(biāo)本。 顯帶觀察 11和 19號染色體短臂的末端顯出綠色 T帶，以 10和 17號染色體長臂的端帶最為鮮明， 1 1 1 21和 22號染色體末端也稍顯綠色， 1 X和 Y染色體不顯端帶。熱處理 30分鐘或更長時(shí)間，就會出現(xiàn) R帶型。 根據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)查明一個(gè)分裂間期細(xì)胞核中僅 有一條 X染色體呈松散狀態(tài)，參加細(xì)胞生理活 動(dòng)，另一條 X染色體則仍保持異固縮的狀態(tài)， 所以染色較深而成為 X小體。 用 1 000轉(zhuǎn) /分 離心 10分鐘，除去上清液，細(xì)胞沉淀物用3∶ 1的甲醇冰醋酸固定劑固定 10分鐘。 如不經(jīng)處理 ， 對觀察有極大的妨礙 。然后，按口腔粘 膜細(xì)胞法進(jìn)行漂洗，干燥和鏡檢。隨后，不同的研究者用同類的熒光染料對男性的各種間期細(xì)胞核，以及精子的頭部進(jìn)行染色，均可觀察到一個(gè)類似于 Y染色體長臂的直徑約。用 %的阿的平染色液染色 15分 鐘以上，然后用 Mcllvaine磷酸緩沖 液洗去剩余的染色液，再滴上新的緩沖液 1~2 滴并加上蓋玻片，立即置熒光顯微鏡下用油 鏡進(jìn)行檢查。 絨毛細(xì)胞 Y小體檢測法 取材、制片同絨毛細(xì)胞 X小體檢查法，然后用 %的阿的平溶液染色 20分鐘左右，用 Mcllvaine緩沖液洗去剩余的染色液 后，再滴上新的緩沖液 1~2滴并加上蓋玻片， 立即置熒光顯微鏡下用油鏡進(jìn)行檢查。 待干后加上數(shù)滴 3%的冰醋酸固定 15分鐘左右 ， 待紅細(xì)胞全部溶解后 ， 用 Mcllvaime緩沖液徹底 沖洗 ， 空氣干燥 。 從而確認(rèn) Y小體是 Y染色體長臂上的一部分。正常男性體細(xì)胞中只有一個(gè) ,正常女性沒有。 絨毛膜細(xì)胞 X小體檢測法 取材方法與絨毛培養(yǎng)法相同。 將細(xì)胞懸液滴入載玻片上，讓其在空氣中干燥后，放入5N HCl中處理 10分鐘，自來水中漂洗數(shù)秒鐘，放入 %甲苯胺藍(lán)染色液中染色 1~ 30分鐘，自來水漂洗，空氣中干燥后，在油鏡下依次觀察細(xì)胞核著色均質(zhì)，核摸完整的細(xì)胞 100個(gè)，并計(jì)數(shù)具靠近核膜邊緣的半月形 X 小體的細(xì)胞數(shù) 羊水細(xì)胞 X小體檢測法 從中期妊娠 （ 16周左右 ） 的孕婦中 ， 經(jīng)羊膜穿刺抽取羊水 5~10ml左右 ， 放入離心管中 ， 以 1000轉(zhuǎn) /分 離心 10分鐘 ，去上清液 ， 加入 3:1甲醇冰醋酸固定劑 5~10ml,固定 30分鐘以后；再以 1000轉(zhuǎn) /分離心 10分鐘 ， 去上清液 ， 再加入新鮮的固定劑 3~5滴制成細(xì)胞懸液；然后按口腔粘膜細(xì)胞 X小體檢測法制片 ， 染色和讀片 。其 X小體與 X染色體的關(guān)系如下 表，即 X小體數(shù)目等于 X染色體數(shù)目減 1。 X小體與 X染色體的關(guān)系 用人體的體細(xì)胞，如口腔上皮細(xì)胞或女性個(gè)體的陰道上皮細(xì)胞，通過特異的處理和染色，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞核膜的內(nèi)緣有一塊染色較深、大小為 1μm左右的呈半月形的小塊，即 X小體。 11號染色體長臂近側(cè)段和 19號染色體短臂近側(cè)段，以及 22號染色體長臂近側(cè)段均顯示典型的中間綠帶。 3. 染色：用吖啶橙染料染色，或者經(jīng)同樣熱變性后用吉姆薩染液染色 5分鐘。 T帶是 R帶的最深染部分 ， 必須用特殊的高熱處理染色體 ， 然后用吉姆薩或 與熒光聯(lián)合染色 。 每次細(xì)胞分裂 ， 染色體丟失其末端的約 100核苷酸 ， 此變短的端粒可為細(xì)胞提供一有絲分裂的時(shí)鐘 。但使用得不多，所以 在此只是作簡單介紹。 染色時(shí)間因材料而異，因吉姆薩染料批號不同、質(zhì)量上有差異，因此其染色液濃度和染色時(shí)間需作適當(dāng)調(diào)整。 滴 AgNO3液時(shí)，不能讓玻片干燥。室溫下風(fēng)
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