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【正文】 36 20 804 1150 1496 4601 25 643 920 1148 3679 30 536 766 997 3065 鏈霉菌基因工程的主要進(jìn)展 1. 建立了許多不同的載體－宿主系統(tǒng)。 主要進(jìn)展續(xù) 1 5. 一些正調(diào)節(jié)基因能影響抗生素的產(chǎn)量。 Genome Streptomyces coelicolor Streptomyces avermitilis Length (bp) 8,667,507 9,025,608 G+C content (%) Proteincoding gene 7,825 7,577 參考書 ? Geic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual ? 鏈霉菌遺傳操作手冊(cè) ? Practical Streptomyces Geics 。 7. 開創(chuàng)了組合生物合成新化合物的理論。 3. 發(fā)現(xiàn)生物合成基因成簇（ cluster），并與抗性基因和調(diào)節(jié)基因連鎖。 鏈霉菌基因克隆策略小結(jié) ? 由上可見，克隆抗生素生物合成的策略是多種多樣的，似乎每一個(gè)策略都能成功地克隆到生物合成基因。 ?Target gene： Milbemycin的生物合成基因 ? 篩選方法和結(jié)果： actIII基因?yàn)樘结樑c Milbemycin和榴菌素產(chǎn)生菌的基因文庫(kù)雜交 ， 獲得了 actIII的同源基因 ， 將這些來自 Milbemycin和榴菌素產(chǎn)生菌的同源 DNA片段轉(zhuǎn)入天藍(lán)色鏈霉菌的 actIII突變株 ， 產(chǎn)生了類似或同樣的放線紫紅素色素 。 這些結(jié)果證明這一策略同樣是可行的 。 方法 6續(xù) ?篩選方法和結(jié)果：選擇不產(chǎn)黑色素的硫鏈絲菌素抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行抗菌活性測(cè)試 ， 結(jié)果從30,000個(gè)菌落中獲得一個(gè)有抗菌活性的轉(zhuǎn)化子 PF151， 從中分離到一個(gè)帶 kb插入片段的質(zhì)粒 pIF900。 ? 從上面的這些例子證明 ， 只要能提純抗生素生物合成途徑的任何一個(gè)酶 ，通過測(cè)定一段氨基酸的順序并依此人工合成一段寡核苷酸探針 ， 就能克隆相應(yīng)的酶基因 、 甚至與此基因連鎖的其他生物合成酶基因 。 方法 5續(xù) ?Target gene：泰樂菌素生物合成基因中 O甲基轉(zhuǎn)移酶 (MOMT)。 用人工合成的寡核苷酸探測(cè)基因文庫(kù) ?由于鏈霉菌 DNA中 G+C的比例很高 (73%左右 )， 因此鏈霉菌基因?qū)γ艽a子利用有明顯的不隨機(jī)性 ， 即密碼子第三位有 90%以上常為 G和 C， 因此 ， 在分析了某一個(gè)抗生素生物合成酶的部分氨基酸順序后 ，就能設(shè)計(jì)出較低程度簡(jiǎn)并性的寡核酸順序 ， 經(jīng)人工合成這段順序后就可用作探針從基因庫(kù)中釣出所需的克隆子 。 限制酶圖譜表明 ， 克隆到的生物合成基因?yàn)?24 kb， otrA和otrB基因位于 DNA片段的兩端 。 克隆抗性基因并分析連鎖的生物合成基因 ?對(duì)已經(jīng)克隆到的放線紫紅素的生物合成基因研究表明：生物合成基因成簇并與抗性基因連鎖 。 兩個(gè)長(zhǎng)操縱子轉(zhuǎn)錄從右到左 ， 每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中至少含有 30個(gè)生物合成基因 。 ?宿主和載體：變青鏈霉菌 66， PstI片段插入到fC31衍生的 KC400噬菌體的 PstI位點(diǎn) 。 可見 ， 突變互補(bǔ)是克隆抗生素生物合成基因最成功的方法之一 。 ? 宿主和載體：阻斷突變株 red E60， 將天藍(lán)色鏈霉菌的 DNA用 BclI和 PstI完全酶解或 MboI部分酶解 ， 將這些 DNA片段分別插入 pIJ702的 BglII、 pIJ350的 PstI或 pIJ922的 BamHI位點(diǎn) 。 ?本方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要了解抗生素生物合成途徑的遺傳信息 ， 但要知道何種酶參與了生物合成以及具有檢測(cè)這種酶的靈敏的分析方法 。 結(jié)果從兩種選擇方法中各獲得一個(gè)克隆子 ， 每個(gè)克隆都帶有 45kb的 BamHI片段 方法 1續(xù) ? Target gene:抗生鏈霉菌中與放線菌素生物合成有關(guān)的吩噁嗪酮 (phenoxazinone)合成酶 (PHS)基因 。 7. 利用已克隆的生物合成基因?yàn)樘结樋寺⊥椿?。plasmid （＜ 10 ? l ）200 ? l T bufferUP and down 2 3 timeswith P buffer2 . 5 ml soft R 2 YEON R 2 YE plateat 28 ℃ ～ 30 ℃ for 18 ～ 24 hwith 2 . 5 ml soft agar plus thiostreptonfor 5 10 d鏈霉菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化的注意點(diǎn) ? PEG的影響：批號(hào)、分子量、濃度 ? R2YE平板的干燥度： 15%左右 ? 加抗生素篩選的時(shí)間 Protocol for transformation of Streptomyces by electroporation s t r a i n1 0 0 m l C R M* I n c u b a t e f o r ～ 2 4 h rC e n t r i f u g a t i o n ( 1 0 , 0 0 0 r p m , 4 ℃ )S u s p e n d i n 1 0 0 m l i c e c o l d 1 0 % s u c r o s es p i nR e s u s p e n d i n 5 0 m l 1 5 % i c e c o l d g l y c e r o lS p i nM y c e r i a1 0 m l o f 1 0 % g l y c e r o l c o n t a i n i n g 1 0 0 ? g / m l l y s o z y m eI n c c u b a t e ( 3 7 ℃ ， 3 0 m i n )W a s h t w i c e w i t h i c e c o l d 1 5 % g l y c e r o lW a s h e d m y c e l i a1 ～ 5 m l 3 0 % P E G 1 0 0 01 0 % g l y c e r o l 、 6 . 5 % s u c r o s e i n d H2OA l i q u o t i n 1 . 5 m l t u b e , 5 0 ? l e a c hF r o z e o n d r y i c e e t h a n o lS t o r e a t 7 0 ℃5 0 ? l a l i q u o tT h a w a t r o o m t e m p e r a t u r eO n i c e1 0 n g 1 ? g p l a s
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