【正文】 ...........9謝辭 ...........................................................................................................................................10基于順鉑抗癌藥物的合成及 DNA 鍵和性質(zhì)的研究共 31 頁 第 3 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊1 引言 金屬抗癌藥物的發(fā)展1965年Rosenberg偶然發(fā)現(xiàn)順二氯二氨合鉑( cis[Pt(NH3)2Cl2]，又稱順鉑)對大腸桿菌的分裂有抑制作用，并于1969年首次報(bào)道了順鉑具有很強(qiáng)的抗癌活性。為此，人們開始展開對其它鉑系抗腫瘤藥物的研究，但結(jié)果并不理想。與順鉑相較，釕配合物毒性相對較小，在生物體內(nèi)易于吸收，也易于代謝而且釕配合物有在腫瘤組織中發(fā)生聚集的特點(diǎn)，能夠與DNA 分子以共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵(靜電結(jié)合、溝面結(jié)合和插入結(jié)合) 方式締合。有數(shù)據(jù)表明，DNA鏈中許多相鄰的堿基間兩個(gè)氮原子距離為340 pm，而順鉑中兩個(gè)氯原子間的距離為330 pm，兩者恰好匹配，形成的鉑化 DNA壽命較長且不易被細(xì)胞蛋白如高移動組(HMG)蛋白識別并修復(fù)，因而將破壞腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制，抑制細(xì)胞分裂，最終殺死腫瘤細(xì)胞。如今，順鉑和卡鉑已成為癌癥化療中不可缺少的藥物。順鉑是第一代鉑類抗癌藥物（），該藥的使用局限性是它的耐藥性及劑量毒性人體器官尤其是對腎臟的損害較大。 核酸的組成與結(jié)構(gòu) 概述構(gòu)成生命物質(zhì)的兩類主要大分子是蛋白質(zhì)和核酸。因此，核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)之一。在生理狀況下，隨著細(xì)胞分裂次數(shù)增加，端粒在復(fù)制分裂過程中將逐漸丟失堿基，從而使端粒漸進(jìn)性縮短。因此，以抑制端粒酶活性為目標(biāo)的腫瘤基因治療研究已成為一種新的藥物作用靶點(diǎn)，而且極有希望成為最安全、有效的治療腫瘤的理想途徑。核苷酸中的堿基分為嘌呤和嘧啶兩類。DNA 分子的結(jié)構(gòu)，有以下三種：第一，DNA 的一級結(jié)構(gòu)。圖 14 核酸一級結(jié)構(gòu)模型第二，DNA的二級結(jié)構(gòu)。在不同濕度和鹽濃度下，DNA的雙螺旋有著不同的構(gòu)象。改變一定的外界環(huán)境條件，如溫度、相對濕度、鹽的濃度以及有機(jī)溶劑等可以使這些構(gòu)型進(jìn)行相互的轉(zhuǎn)化，并且這些轉(zhuǎn)變從本質(zhì)上都是改變核酸分子的內(nèi)在運(yùn)動來實(shí)現(xiàn)的。三螺旋DNA一般是由一條寡核苷酸鏈通過與雙鏈DNA形成Hoogsteen 鍵或反Hoogsteen 鍵，在其大溝處緊密纏繞而成。圖 16 三螺旋 DNA 結(jié)構(gòu) G四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系 G四鏈體基于順鉑抗癌藥物的合成及 DNA 鍵和性質(zhì)的研究共 31 頁 第 7 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊G四鏈體（ Gquadruplex）是一類特殊的DNA二級結(jié)構(gòu)，在基因組中的一些鳥嘌呤富集區(qū)域，具有形成這一特殊結(jié)構(gòu)的傾向。四鏈體結(jié)構(gòu)是由富含G DNA單鏈，在特定離子強(qiáng)度和pH值條件下，由單鏈之間或單鏈內(nèi)對應(yīng)的G殘基形成Hoogsteen 堿基配對，從而使四條或四段富G DNA單鏈旋聚成一段特殊的DNA二級結(jié)構(gòu)。其中每個(gè)G 堿基既是氫鍵的受體，又是氫鍵的給體，他們在結(jié)構(gòu)上是等價(jià)的。N NNNRHNHHONNNNRHNHHONNNNRHNHHONNNNRH N HHO圖 17 Gquadruplex 結(jié)構(gòu)大量研究表明含不同 G 序列所形成的四螺旋結(jié)構(gòu)是不同的，即使是相同的序列也可以按不同的方式進(jìn)行組裝。基于順鉑抗癌藥物的合成及 DNA 鍵和性質(zhì)的研究共 31 頁 第 8 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊圖 幾種典型的 G四鏈體結(jié)構(gòu) a：分子間四聚體結(jié)構(gòu)(平行)；b：分子間二聚體鄰位發(fā)夾型結(jié)構(gòu)(反平行) ；c：分子內(nèi)椅狀結(jié)構(gòu)(反平行)；d：分子內(nèi)藍(lán)狀結(jié)構(gòu)(反平行) ；e ：分子內(nèi)螺旋槳狀結(jié)構(gòu) (平行)；f：分子內(nèi)混合型結(jié)構(gòu) G四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系 端粒是由高度重復(fù)序列的端粒DNA 和端粒結(jié)合蛋白組成的復(fù)合物。由于缺乏模板的引導(dǎo)，染色體合成過程中傳統(tǒng)的DNA 聚合酶就無法完全合成這個(gè)末端懸掛，從而造成端?？s短，這就是所謂的“末端復(fù)制問題” 。端粒的主體是雙螺旋結(jié)構(gòu)，富GT 鏈與富CA 鏈配對，但3′末端突出為一段單鏈懸掛。 圖 左圖為人染色體末端的端粒 DNA；右圖為人端粒結(jié)構(gòu)示意圖基于順鉑抗癌藥物的合成及 DNA 鍵和性質(zhì)的研究共 31 頁 第 9 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊正常細(xì)胞的端粒隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行性縮短，在每一次的復(fù)制循環(huán)中端粒都要減少50100個(gè)堿基對，細(xì)胞在進(jìn)行大約50次分裂后就開始衰亡。端粒酶是一種核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物，它能以自身RNA為模板，將真核生物染色體末端端粒DNA加以延伸的酶，所以它又被稱為特化RNA依賴性 DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、端粒末端轉(zhuǎn)移酶。在正常的體細(xì)胞中，端粒酶的活性得到抑制，所以細(xì)胞每分裂一次，端粒就會縮短一些，當(dāng)達(dá)到一個(gè)臨界長度時(shí)，細(xì)胞染色體就會失去穩(wěn)定性，然后細(xì)胞將發(fā)生衰亡和凋亡。端粒酶抑制劑的研究主要針對其不同的組分及不同的結(jié)構(gòu)，由于 G四螺旋能阻斷 RNA 聚合酶，因此當(dāng)基因密碼區(qū)的富含 G 重復(fù)序列形成 G四螺旋而又不易解聚時(shí)，會起到抑制 RNA聚合酶的作用，從而引起早期轉(zhuǎn)錄的停止。綜合以上所述，G四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系可以歸結(jié)為下面這個(gè)流程圖。 （4）用熒光光譜、紫外光譜觀察兩種不同輔助配體的釕配合物與 DNA 的 G四鏈體的鍵合作用及性質(zhì)。1) 外部堆積模式。由于溶液中小分子配體G四鏈體之間的結(jié)合處于動態(tài)平衡狀態(tài)，導(dǎo)致NMR圖譜很難解析，因此，關(guān)于復(fù)合物的NMR結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)非常缺乏，給研究小分子配體的結(jié)合模式帶來了困難。一般來說，DNA 加入金屬配合物后，會對配合物的光、氧化還原等化學(xué)物理性質(zhì)產(chǎn)生影響，通過研究DNA加入前后配合物性質(zhì)的變化可對配合物與DNA的相互作用進(jìn)行初步研究。其中金屬離子向配體的電子躍遷發(fā)生在金屬離子具有充滿的或接近充滿的t2g 軌道，而配體具有最低空Π軌道的配合物中。當(dāng)配合物插入到DNA 堿基對時(shí)，對應(yīng)的吸收峰產(chǎn)生明顯的減色效應(yīng)，并伴有一定程度的紅移。并根據(jù)強(qiáng)度的變化來判斷與 DNA 作用的強(qiáng)弱。這樣的一種現(xiàn)象便有了一定的選擇性變化，更容易區(qū)分 G四鏈體的構(gòu)型轉(zhuǎn)化，反應(yīng)配合物和 DNA 的結(jié)合模式。核酸由多鏈結(jié)構(gòu)(雙螺旋或四螺旋) 變?yōu)閱捂溄Y(jié)構(gòu)的中點(diǎn)溫度反應(yīng)了該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，該溫度的變化也反應(yīng)了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化。瞬時(shí)共振拉曼光譜：可以探測微環(huán)境的變化對配合物激發(fā)態(tài)的性質(zhì)或行為的影響，從而可以用來研究配合物與 DNA 的作用機(jī)理。由于密度泛函方法考慮了電子相關(guān)，計(jì)算速度快，并且能有效地估算配合物的分子結(jié)構(gòu)、電子結(jié)構(gòu)及其與 DNA 相互作用的前線分子軌道，引起了理論化學(xué)家的注意。在表征過程中特別是質(zhì)譜方面上，有些系列的配合物均與應(yīng)得的分子量有偏差，說明反應(yīng)過程中可能發(fā)生了其他的副反應(yīng)，所以實(shí)驗(yàn)步驟還有待探索。 基于順鉑抗癌藥物的合成及 DNA 鍵和性質(zhì)的研究共 31 頁 第 15 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊ 配合物的合成及表征 配體的合成1）5硝基鄰菲羅啉的合成 NN NN150℃ ， refluxH2SO4N3 NO2MolecularWeight: MolecularWeight:稱取鄰菲羅啉 5g 置于 100mL 圓底燒瓶，加入 30mL 濃硫酸，緩慢升溫至 150℃，再逐滴加入 15mL 濃硝酸，反應(yīng)物繼續(xù)回流 3 小時(shí)后停止反應(yīng)，冷卻至室溫，將反應(yīng)混合液傾入含 500g冰的燒杯中，用事先配制好的 NaOH 溶液（50g NaOH 溶于 200mL 左右蒸餾水）調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH 值至接近中性（pH~5） 。繼續(xù)回流 30 分鐘后停止反應(yīng)，冷卻至室溫后，將反應(yīng)液倒入 300600mL 冰水中，靜置一夜后抽濾，濾餅分別用水、甲醇和氯仿洗滌后干燥，得產(chǎn)物 產(chǎn)率 35%。4）雙呋喃基 dpqdf 的合成NNNH2NH2OOOO NNNNOOChemicalForula::12H0N4MolecularWeight::℃2d5，6二氨基1，10 鄰菲羅啉（，） ，2，2’雙呋喃二酮（， ） ，溶于 20mLDMF 置于 100mL 三頸瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流 2 天。1)(dpqdf)PtCl2 的合成將 ()加入一圓底燒瓶中，向其中加入 35mL 乙二醇加熱近沸，全部溶解后，緩緩加入用 5ml 高純水溶解的 ()的 K2PtCl4(梅紅色晶體)，130 oC 加熱回流6 小時(shí)，出現(xiàn)紅棕色沉淀。2)[(dpqdf)Pt(en)](PF6)2 的合成將乙二胺 240μL 加入混有 20mL 乙二醇和 (dpqdf)PtCl2 的圓底燒瓶中，加熱 100oC 回流3h，未全部溶解。濃度確定：用紫外分光光度計(jì)測量 DNA 在 260nm 的吸光度值 A260。） ，分別溶于緩沖液 1 及緩沖溶液 2 中，緩沖溶液 476uL，密封加熱到 90℃，并保持 5 分鐘。. 配合物與 G四鏈體相互作用的紫外 ——可見光譜滴定在紫外可見吸收光譜儀的雙光路系統(tǒng)中，先往參比池中加入 475uL 緩沖溶液做參比，基線穩(wěn)定后，往樣品池中加入濃度為 10uM 的配合物溶液 25uL，用微量進(jìn)樣器每次往參比池和樣品池中加入 5uL 的 DNA 儲備液，混勻 5min 后，使 DNA 在配合物溶液中的濃度比值不斷增加，直至飽和。價(jià)鍵理論認(rèn)為，每個(gè)分子都有一系列嚴(yán)格分立的能級，處于低能級的分子受到光的能量激發(fā)時(shí)，可吸收特征頻率的光子而躍遷到較高的能級，進(jìn)而產(chǎn)生吸收光譜。在紫外光譜圖中(圖442 、43 、44)，300 nm 以下的吸收峰為配體間的 Π Π*躍遷峰（IL)， 而可見光區(qū)450 nm 附近的吸收峰為配合物 的MLCT 峰，可以歸屬為Ru(dΠ) dpqdf( Π*)的躍遷吸收。從圖中可以看出，對于K +緩沖條件下，以 MLCT 峰看，配合物與DNA 作用后的減色率比在Na +緩沖條件下的減色率大。30 40 5001absWavelngth/nm 合 5uL DNA 10 5uL A 20 DN 5uL A 30 5uL DNA 40 圖 43 鉀離子緩沖溶液配合物 2 與端粒 Gquadruplex 作用的紫外滴定曲線,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8μM)。以上信息表明配合物可以與AG 3(T2AG3)3 的堿基發(fā)生強(qiáng)烈的ΠΠ*作用。但是，對于插入劑結(jié)合到四鏈體里面的G四分體之間是相當(dāng)困難的，不僅僅是因?yàn)樗逆滙w是一個(gè)穩(wěn)定和剛性的結(jié)構(gòu)，同時(shí)因?yàn)槠茐乃逆滙w的完整性需要耗費(fèi)很高的能量。基于順鉑抗癌藥物的合成及 DNA 鍵和性質(zhì)的研究共 31 頁 第 23 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊0 2 4 6 coration/uM圖 47 DNA 滴定鉀離子緩沖溶液配合物 2 在 450nm 左右的吸收峰滴定趨勢圖，[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。富G 的鏈能在K+ 、Na+等陽離子誘導(dǎo)下形成由堆積的四基于順鉑抗癌藥物的合成及 DNA 鍵和性質(zhì)的研究共 31 頁 第 24 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊分體組成通過氫鍵穩(wěn)定的Gquadruplex 結(jié)構(gòu)。熒光增強(qiáng)幅度的大小，基本上可以反映出配合物與DNA 作用的強(qiáng)弱。說明配合物與G四鏈體的鍵合能力很強(qiáng)。基于順鉑抗癌藥物的合成及 DNA 鍵和性質(zhì)的研究共 31 頁 第 25 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊