實驗專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關系(文件)
【正文】 專題實驗中，我們將用明膠酶譜法檢測一系列腫瘤患者以及對照正常人血清中 MMP2與 MMP9的活性，以探討其在腫瘤患者血清中的表達水平，從而加深同學們對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程的認識。該凝膠通過染色，可呈現(xiàn)酶作用的痕跡。 以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳 。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率 聚丙烯酰胺凝膠特性 聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠濃度越大，網(wǎng)孔越小，影響大分子的移動；凝膠濃度越小網(wǎng)孔越大，對小分子的分子篩效應越小。而 HCl完全 解離成氯離子，氯離子 移動 最快 ，是“快離子”。 濃縮膠的作用是把加入的樣品濃縮至一個狹窄的區(qū)帶 MMP2（明膠酶 A）和 MMP9（明膠酶 B）的底物是明膠。 4. 用考馬斯亮藍染色后，就能看到酶作用的痕跡 ——藍色背景下的“白點”。按下表配10％分離膠，加入 TEMED后立即搖勻即可灌膠，然后膠上加一層異丙醇，以隔離空氣中的氧，促進凝膠聚合。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。l 25 181。l樣品 。 2. 明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和 PH值等因素的影響，因此緩沖液 配制應嚴格準確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。 注意事項 ?我們知道，核酸中的密碼指導蛋白質(zhì)的合成，而核酸的合成又需要多種酶來完成。 ?可自選討論題目，你感興趣的題目是： 課堂分組討論 。試推測：先有蛋白質(zhì)還是先有核酸？說明理由。 5. 明膠要 4℃ 保存，配好后 1周內(nèi)使用 。 5. 凝膠的處理： a) 電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫搖動下洗滌 1h，其間換液一次； b) 棄去洗滌緩沖液，然后加入孵育緩沖液沒過膠面，至 37℃ 恒溫箱中， 24h后取出； c) 棄去孵育緩沖液，加入 %考馬斯亮藍染液染色約30min，回收染液，加入脫色液脫色至藍色背景和白色條帶均十分明顯時，用 5％乙酸中止脫色； d) 待凝膠在 5％乙酸中恢復到適當大小后，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果，以白色條帶的凈光密度值相對定量樣品中酶活性。l 5 181。l 50 181。按下表配 4％的濃縮膠。 （二）明膠酶譜法 1. 樣品制備 : 適量血清、條件培養(yǎng)基濃縮液樣品，肝組織總蛋白提取液樣品 直接與 5 SDS 樣品緩沖液混勻進行下一步實驗，如酶活性太高造成顯帶不理想
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