【正文】 Wh/2＝標準偏差（standard deviation，σ)正態(tài)分布曲線x＝177。峰面積(peak area，A)峰與峰底所包圍的面積。死體積(dead volume，V0)由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據(jù)的空間。V0＝Ft0（F為流速）保留時間(retention time，tR)從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。R)扣除死時間后的保留時間。R（或tR）可用于定性。3．柱效參數(shù)理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。N與柱長成正比，柱越長，N越大。R)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。 在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。R）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應用更廣泛。從本質上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。當W1＝W2時，R＝。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。2） 樣品加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。2．色譜流出曲線方程及定量參數(shù)（峰高h和峰面積A）Cmax就是色譜峰的峰高。把Cmax＝h和Wh/2＝，即得A＝Wh/2h，此為正常峰的峰面積計算公式。 1956年荷蘭學者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論速率理論。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。毛細管無填料，A＝0。分子擴散項B/u＝2γDm/u。γ是考慮到填料的存在使溶質分子不能自由地軸向擴散，而引入的柱參數(shù)，用以對Dm進行校正。溶質分子在流動相和固定相中的擴散、分配、轉移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。這是由于溶質分子進入處于固定相孔穴內的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。因此應采用低粒度固定相和低粘度流動相。采用單分子層的化學鍵合固定相時Hs可以忽略。 從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進樣時間要短。④適當?shù)牧魉佟?．柱外效應色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：為了減少柱外效應，首先應盡可能減少柱外死體積，如使用零死體積接頭連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內腔體積應盡可能小。由于HPLC的特殊條件，當柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時，柱外效應越顯得突出。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。 最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。輸液泵應具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應＜%，這對定性定量的準確性至關重要；②流量范圍寬，~10 ml/min范圍內連續(xù)可調，制備型應能達到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300kg/cm2；④液缸容積??；⑤密封性能好，耐腐蝕。 泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。 ①防止任何固體微粒進入泵體，因為塵?；蚱渌魏坞s質微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。micro。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內超聲清洗。3．梯度洗脫等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數(shù)目較少，性質差別不大的樣品。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。 ②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。 ④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態(tài)。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。2．停流進樣。3．閥進樣。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進樣引起的峰展寬。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。用于大量樣品的常規(guī)分析。 色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。即使最好的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經(jīng)過拋光。micro。柱內徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。 因強調分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3amp。細管徑柱的優(yōu)點是：①節(jié)省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實現(xiàn)LCMS聯(lián)用。 但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優(yōu)點。 色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。micro。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。 一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。 色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠飽和，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。 ⑤　避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。micro。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。 陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。 ⑦　保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。 柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。 每次工作完后，最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。高壓液相色譜HPLC培訓教程(五) 四、檢測器其作用是把洗脫液中組分的量轉變?yōu)殡娦盘?。通用型檢測器測量的是一般物質均具有的性質，它對溶劑和溶質組分均有反應，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器。濃度型檢測器的響應與流動相中組分的濃度有關，質量型檢測器的響應與單位時間內通過檢測器的組分的量有關。噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。對質量型檢測器，它表示在單位時間內通過檢測器的單位質量的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mV通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。 檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數(shù)值越小，檢測器性能越好。輸出信號與樣品量最好呈線性關系，這樣進行定量測定時既準確又方便。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。l。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。 UV檢測器是HPLC中應用最廣泛的檢測器。micro。5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10amp。通常A＝BCx，B為響應因子，當x=1時，為線性響應。4）線性范圍(linear range)：指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。又稱為敏感度(detectability)。3）檢測限(detection limit)對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mV2．性能指標1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內的變化為漂移。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應。1．分類1）按原理可分為光學檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學檢測器（如吸附熱）、電化學檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學檢測器（電導、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用。在后兩種情況發(fā)生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那幺可以省略最后用水沖洗這一步。 ⑥　經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。 ③　一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。 ②　應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。5%或177。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。micro。micro。m。micro。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。 色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。micro。 六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進樣量準確，重復性好（%），操作方便。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)鬼峰；另一缺點是保留時間不準。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。現(xiàn)在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。二、進樣器 ③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產(chǎn)生氣泡。 ①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。 兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。 梯度洗脫有兩種實現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內梯度）。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。原因可能是泵內有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應措施排除故障：泵的入口都應連接砂濾棒（或片）。micro。2．泵的使用和維護注意事項恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。 輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。 目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計算機、工作站及網(wǎng)絡處理系統(tǒng)。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。高壓液相色譜HPLC培訓教程(四) III．HPLC系統(tǒng)其次，希望將樣品直接進在柱頭的中心部位，但是由于進樣閥與柱間有接頭，柱外效應總是存在的。一般在液相色譜中，uopt很?。▇），在這樣的線