【正文】 丙酸 乙酸 重干胞細(xì)A+t /h度濃酸Bt /h發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞干重 ( ) 、 P H A ( ) 和 NH 4 + 濃度 ( ) 的變化發(fā)酵過(guò)程中乙酸 ( ) 、丙酸 ( ) 、乳酸 ( ) 和丁酸 ( ) 濃度的變化 3. 有機(jī)廢水生產(chǎn) PHAs的機(jī)理研究 (1) 廢水中大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子有機(jī)酸 厭氧微生物己糖降解最重要的代謝途徑是 EMP和 HMP途徑，先生成丙酮酸，然后形成揮發(fā)性有機(jī)酸、乳酸等。 ? 15 g/L。 假如用己烷進(jìn)行內(nèi)部溶劑萃取時(shí)，因?yàn)樵诎l(fā)酵系統(tǒng)中加入揮發(fā)性溶劑，會(huì)導(dǎo)致傳氧困難，即便細(xì)胞處于產(chǎn)物合成的旺盛期也會(huì)減少產(chǎn)物的生成，即所謂的“相毒性” (phase toxocity)。 ，應(yīng)用基因突變來(lái)改造微生物原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。 這標(biāo)志著代謝工程作為一門學(xué)科的誕生 。 代謝工程通過(guò)對(duì)特定的生化反應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行修飾或用重組 DNA技術(shù)導(dǎo)入新的生化反應(yīng)來(lái)改進(jìn)蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。完整的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)就是代謝工程必須要考察的，重視代謝網(wǎng)絡(luò)和目標(biāo)產(chǎn)物的熱力學(xué)可行性、代謝流及其控制。 代謝工程的實(shí)質(zhì)： 對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定量分析，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行代謝改造（代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)），以最大限度地提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率 代謝工程設(shè)計(jì)的主要內(nèi)容包括： ① 生物合成相關(guān)代謝調(diào)控 和代謝網(wǎng)絡(luò)理論； ② 代謝流的定量分析； ③ 代謝網(wǎng)絡(luò)的重新設(shè)計(jì)； ④ 中心代謝作用機(jī)理及相關(guān)代謝分析； ⑤ 基因操作 。 研究手段： 代謝工程注重酶學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)、分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及現(xiàn)代數(shù)學(xué)的理論及技術(shù)為研究手段，在細(xì)胞水平上闡明代謝途徑與代謝網(wǎng)絡(luò)之間局部與整體的關(guān)系、胞內(nèi)代謝過(guò)程與胞外物質(zhì)運(yùn)輸之間的偶聯(lián)以及代謝流流向與控制的機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)工程和工藝操作達(dá)到優(yōu)化細(xì)胞性能的目的。 ，利用基因克隆改變代謝流，擴(kuò)展和構(gòu)建新的代謝途徑，盡可能最大限度地提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率，已取得令人矚目的成果。 ，活細(xì)胞這種自身固有的代謝網(wǎng)絡(luò)的遺傳特性并不是最佳的?！? 25g/L t 5. PHAs分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué) (1)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) ))/(1(/ NCNC ssssss ????C / N 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響○為實(shí)驗(yàn)值，曲線代表模型計(jì)算值 (2) PHAs形成模型 RR xdtdxdtdp ??t /hPH As 積累與模型計(jì)算值的比較○為實(shí)驗(yàn)值，曲線代表模型計(jì)算值 6. 以有機(jī)廢水酸化產(chǎn)物為底物進(jìn)行 PHAs流加發(fā)酵 （ 1）流加發(fā)酵過(guò)程曲線 將 UASB出水中的總有機(jī)酸濃度濃縮至 150 g/L左右，進(jìn)行 PHAs生產(chǎn)的 流加發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖 t / h度濃量質(zhì)的質(zhì)物各流加發(fā)酵過(guò)程中 DC W 、 P HA s 、 NH 4 + 、有機(jī)酸的濃度變化□ DCW ； P HA ；? 丁酸；● 乙酸；? 丙酸；■ NH 4 + (2)酸化廢水發(fā)酵過(guò)程中丁酸對(duì) PHAs的產(chǎn)率的變化 酸丁發(fā)酵時(shí)間酸丁發(fā)酵時(shí)間分批發(fā)酵過(guò)程中丁酸對(duì) P H A s 的產(chǎn)率變化流加發(fā)酵過(guò)程中丁酸對(duì) P H A s 的產(chǎn)率變化 四 . 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng) 生物反應(yīng)與分離 (或分配 )相組合的技術(shù)： 選擇性地從培養(yǎng)液中連續(xù)分離有抑制性、有毒性或不穩(wěn)定性產(chǎn)物，或者將底物以一種可控的方式添加到培養(yǎng)液中，對(duì)生物反應(yīng)過(guò)程都能產(chǎn)生極大的促進(jìn)作用 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng)也稱為原位 (in situ)產(chǎn)物分離過(guò)程或提取生物轉(zhuǎn)化，即在生物反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)，選擇一種合適的分離方法及時(shí)將對(duì)生物反應(yīng)有抑制或毒害作用的產(chǎn)物或副產(chǎn)物選擇性地從生產(chǎn)性細(xì)胞或生物催化劑周圍移走 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng)具有如下三個(gè)特征： (1)耦合過(guò)程是一種集成式單元操作，其生物反應(yīng)器具有特殊的結(jié)構(gòu) (2)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物及時(shí)分離的方法有很多，但必須考慮產(chǎn)物的特性及具體的生物反應(yīng)體系來(lái)合理選擇和設(shè)計(jì) (3)耦合過(guò)程作為一種新的反應(yīng)工程技術(shù)，可適用于各種生物反應(yīng)過(guò)程 分離技術(shù)的選擇主要基于四個(gè)方面的因素： (1)分離技術(shù)應(yīng)當(dāng)具備生物相容性，適宜的分離技術(shù)應(yīng)當(dāng)對(duì)生物反應(yīng)不造成負(fù)面影響，不會(huì)造成生物催化劑或細(xì)胞的失活、變性和死亡，也不會(huì)改變生物反應(yīng)的代謝和調(diào)節(jié)機(jī)制； (2)應(yīng)當(dāng)考慮產(chǎn)物或副產(chǎn)物的物理化學(xué)特性和生物學(xué)特性； (3)考慮系統(tǒng)的流體特性，因?yàn)榱黧w力學(xué)性質(zhì)決定并影響分離過(guò)程的傳質(zhì)，從而影響分離的容量和速度，如高粘度的非牛頓型流體就不能用膜分離技術(shù)；(4)考慮工程及經(jīng)濟(jì)因素，理想的分離技術(shù)應(yīng)當(dāng)是操作費(fèi)用低、性能穩(wěn)定、工程上易于實(shí)現(xiàn)的技術(shù) 1. 隨程溶劑萃取 ? 包括內(nèi)部隨程萃取和外部隨程萃取兩種方式 (1) 內(nèi)部隨程萃取是指萃取劑在反應(yīng)器中與培養(yǎng)基直接接觸，以便將產(chǎn)物萃取到溶劑中去 (例如，在利用帚狀地霉發(fā)酵生產(chǎn)酯類風(fēng)味物質(zhì)的研究中，內(nèi)部溶劑萃取技術(shù)得到了很好的應(yīng)用 ) ? 內(nèi)部溶劑萃取的特點(diǎn)是 ∶ 溶劑和液相混合均勻，因而有利于傳質(zhì)的進(jìn)行；但溶劑也可能在培養(yǎng)液中形成穩(wěn)定的乳化作用，這對(duì)溶劑與產(chǎn)物的分離不利 (2) 外部隨程萃取是指萃取劑和培養(yǎng)液在反應(yīng)器外的萃取裝置中逆流接觸，從而萃取產(chǎn)物的過(guò)程 164。 代謝方程分別為 ∶ C6H12O6 + 4H2O→2CH 3COO + 2HCO3 + 4H+ + 4H2 C6H12O6 + 2H2 →2CH 3CH2COO + 2H2O +2H+ C6H12O6 + 2H2O →CH 3CH2CH2COO + 2HCO3 +3H+ +2H2 C6H12O6 →2CH 3CHOHCOO + 2H+ (2) 有機(jī)酸合成 PHAs的代謝途徑 ? R. eutropha 利用小分子有機(jī)酸合成的 PHAs主要為聚羥基丁酸 (PHB)、羥基丁酸和羥基戊酸的共聚物 (PHBV) ? 以乙酸、丙酸、乳酸和丁酸為碳源時(shí) PHAs的合成途徑 : 2 . 3 酮硫解酶4 . P H B 合成酶3. 乙酰乙酰 C o A 還原酶1. 硫激酶乙酰 C o A乙酰乙酰 C o A3 羥基丁酰 C o AC o A S H N A D P HN A D PC o A S HP H BC o A S H乙酸1 234丙酸 丙酰 C o A 3 酮戊酰 C o A 3 羥基戊酰 C o A乙酰 C o A 乙酰乙酰 C o A 3 羥基丁酰 C o AP HB VCO 2C o AS H1. 硫激酶 酮硫解酶 3. 乙酰乙酰 C o A 還原酶 4. 脫羧酶系 HB V 合成酶124 5NADNADH3NADNADH3C o AS HC o AS H2 NAD NADH乳酸 丙酮酸乙酰乙酰 C o AC o AS HNADH乙酰 C o ACO 21. 脫氫酶 HB 合成酶2. 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體4. 乙酰乙酰 C o A 酮硫解酶3 羥基丁酰 C o AP HBC o AS HNA DP HNADP1 2345NAD丁酸 丁酰 C o A 2 烯丁酰 C o AA TP A M P + 2 P iC o A S HF A D 2F A D HH O21. 硫激酶 2. 脫氫酶 3. 水化酶 4. 聚合酶H O23 羥基 丁酰 C o A( D 型 )P H BC o A S H3 羥基丁酰 C o A( L 型 )3 酮 丁酰 C o AN A D N A D H1 2 34 (3)不同有機(jī)酸對(duì) PHAs的產(chǎn)率與理論產(chǎn)率的比較 不同有機(jī)酸對(duì) PHAs的產(chǎn)率與理論產(chǎn)率的比較 一步法碳源 N AD P H 再生 P H As Yp ct h eo r/( )/ g ? g 1Yp c/Y c e ll c/兩步法Yp c/乙酸 異檸檬酸 P H B 0. 48 0. 12 0. 24 0. 27丙酸 異檸檬酸 P H B V 0. 58 ～ 0. 68 0. 18 0. 19 0. 32乳酸 不需要 P H B 0. 48 0. 19 0. 16 0. 33丁酸 異檸檬酸 P H B 0. 65 0. 32 0. 14 0. 41 在一步發(fā)酵法中，由于所消耗的有機(jī)酸有一部分用于合成細(xì)胞的合成，因而四種有機(jī)酸對(duì) PHAs的實(shí)際產(chǎn)率均小于兩步法，但它們對(duì) PHAs和細(xì)胞的產(chǎn)率之和卻大于兩步法的產(chǎn)率 (4) 產(chǎn)酸相產(chǎn)物分布及其影響因子的研究 (a) HRT對(duì)酸化產(chǎn)物分布的影響 度濃酸機(jī)有丙酸乳酸丁酸乙酸HRT對(duì)酸化產(chǎn)物分布的影響 (b) 不同 pH條件下 UASB反應(yīng)器出水產(chǎn)物分布 pH度濃量質(zhì)酸水出U A S B 反應(yīng)器中 pH 值對(duì)出水酸分布的影響 丁酸 乙酸 丙酸 乳酸 4. 不同初始酸濃度對(duì) PHAs發(fā)酵過(guò)程的影響 t不同初始酸濃度對(duì) 細(xì)胞干重 的影響初始酸濃度∶ ○ 5 g / L ；□ 1 0 g / L ；? 1 5 g / L ； 2 0 g / L ；◇ 2 5 g / L當(dāng)硫酸銨濃度為 ，初始酸濃度在 20g/L左右較佳 ta c e ti c a c i dtbu tyr ic aci dpr op i on i c aci d乙酸、丁酸和丙酸濃度與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系初始酸濃度∶ ○ 5 g / L ；□ 1 0 g / L ；? 1 5 g / L ； 2 0 g / L ；◇ 2 5 g / L丁酸消耗速率大大超過(guò)乙酸和丙酸的消耗速率 , 當(dāng)初始酸濃度為 5 、 1 20和 25 g/L時(shí)，最終發(fā)酵液中殘留的丁酸濃度為 ∶ 0、 、 、 PHAs濃度的變化 殘留細(xì)胞量隨時(shí)間的變化 初始酸濃度 : ○ 5 g/L。此階段的細(xì)菌種類多，代謝能力強(qiáng)，繁殖速度快。 塑料制品種類繁多 ， 難以分揀回收 ? (5)對(duì)生態(tài)環(huán)境危害大 。 江河湖泊 ， 田野山川無(wú)處不有 ? (2)污染物增長(zhǎng)量快 。鳥(niǎo)苷酸鈉鹽 )生產(chǎn)過(guò)程 ? XMP＋ NH3＋ ATP→ GMP＋ AMP＋ PPi ? （ 2） ATP(腺嘌呤核苷 539。 可根據(jù)這些物質(zhì)在菌體內(nèi)的實(shí)際含量 ， 用類似于上式的方法確定其需要量 ? 當(dāng)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量與培養(yǎng)基組成之間的關(guān)系很復(fù)雜 ， 不能用解析函數(shù)的方式表示時(shí) ， 可采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法確定最優(yōu)初始濃度 ? 利用最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法 ， 即使不能提高產(chǎn)量 ， 也可探索培養(yǎng)基組分的最小需用量 ， 從而避免不必要的浪費(fèi) 第三部分 生物反應(yīng)過(guò)程的系統(tǒng)優(yōu)化技術(shù) 一 .系統(tǒng)優(yōu)化技術(shù)概述 二 .ATP再生系統(tǒng)及其在谷胱甘肽生物合成中的應(yīng)用 三 .有機(jī)廢水處理和聚羥基烷酸生產(chǎn)的耦合系統(tǒng) 四 .生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng) 一 .系統(tǒng)優(yōu)化技術(shù)概述 ? 奧地利理論生物學(xué)家貝塔朗菲于 1937年第一次提出 ,系統(tǒng)是 “ 一個(gè)相互作用的諸要素的綜合體 ” 。在單一菌體的結(jié)構(gòu)模型中，將整個(gè)菌體分為兩種或兩種以上成分，并認(rèn)為代謝過(guò)程是各種成分共同作用的結(jié)果。生物相分離模型 微生物群體 是將菌體作為與培養(yǎng)液 ( 連續(xù)相 ) 分離的生物相處理所建立的決定論模型。 ???? NOHC 3. 產(chǎn)率系數(shù) ? (1)宏觀產(chǎn)率系數(shù) ? 宏觀產(chǎn)率系數(shù) (或稱得率系數(shù) )Yi/j是化學(xué)計(jì)量學(xué)中一種非常重要的參數(shù)，常用于對(duì)碳源等底物形成菌體或產(chǎn)物的潛力進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中 i表示菌體或產(chǎn)物， j表示底物 ? 例如，菌體對(duì)底物的產(chǎn)率系數(shù)可表示為： dsdxrrdtdsdtdxSSXXSXYsxttsx ???????????//00/ 生物反應(yīng)過(guò)程中宏觀產(chǎn)率系數(shù)的定義總覽 產(chǎn)率系數(shù) 組分間的反應(yīng)或關(guān)系 定義YX/S S → XYX/S= rX/rSYX/ O O 2 → XYX/O= rX/rOYP /S S → PYP /S= rP/rSYC/S S → CO2YC/S= rC/rSYP /O O2→ P Y P /O = r P /r OYHv / S S → HvYHv / S= rHv/rsYC/O O 2 → CO 2YC/O= rC/rOYHv /O O 2 → HvYHv