【正文】 1克肝或 108細(xì)胞是 510 毫克，在 260nm和 280nm 處 分離外周血白細(xì)胞 : 改裝 wyman 白色芯片 77:67546758(1980) 1050ml 外周血抗凝、 EDTA 是首選 . 用離心機(jī) 300xg(1200 年貝克曼的 RPM和 TJ6 離心機(jī) )室溫下離心顆粒細(xì)胞 10分鐘 . 清除及凍結(jié)血漿 (如有需要 ). 黃色細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到另一個(gè)管中 . 在 PBS中混懸其余黃色細(xì)胞層和紅細(xì)胞 ,用 %的 EDTA(1:186 稀釋， EDTA )和 respin. 加上 初步收集黃色 細(xì)胞層 ,旋轉(zhuǎn)一次或兩次降低紅細(xì)胞并轉(zhuǎn)移白細(xì)胞到一個(gè)新的管中 . 最后含有大約等量白血細(xì)胞數(shù)量和紅血球是較好的 . 3 個(gè)小時(shí) ,同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn) 1020ml 在預(yù)先加熱 55℃溶解溶液 (1mM EDTA,10 mM TrisHCl,pH ,10 mM 氯化鈉 ,1%SDS 和 100微克 /毫升蛋白酶鉀 ). 34倍苯酚 /氯仿溶液 ,每次丟棄下層 . 乙醚或氯仿提取 . 不應(yīng)看到的 提取后溶液有血紅蛋白 . .在 12ml混懸液中 ,處理 RNAse 20ul/ml, 1 小時(shí) ,37℃ . 3 倍酚提取 . 乙醇沉淀、 混懸液 . 一個(gè)典型的 DNA 產(chǎn)量為 200400181。l 5 M NaCl 400 181。一些實(shí)驗(yàn)也建議補(bǔ)充同等體積的 40%甘油和半體積的 M NaCl Send ments and updates to Dr. Bart Frank, Arthritis and Immunology Program, OMRF 蛋白電泳凝膠考馬斯亮藍(lán)染色 1. 經(jīng)蛋白電泳凝膠 ,凝膠轉(zhuǎn)移至染色圓托盤 . 放入 ~200毫升蛋白質(zhì)凝膠染色試劑 . 2. 微波 ~45秒 ,直到溶液剛開始煮沸 . 在常溫輕輕震蕩孵育 1015分鐘 . 加熱使凝膠染色速度 . 另外 ,泡膠著色為 1小時(shí)室溫 . 3. 把染液收回瓶以后再用 . 用水漂洗凝膠 . 放入 ~200 毫升蛋白質(zhì)凝膠脫色試劑 . 微波 ~45 秒 ,直到溶液剛開始煮沸 . 在常溫 15分鐘。 1 mM EDTA) 600毫升溶液 : g Tris ml ， EDTA pH用約 7滴濃鹽酸調(diào)至 ，用巴斯德吸管 (穿酸橡皮手套 )或 4 ml ， 1 M HCl. 600 毫升 QS 用水和高壓器 . RNAse (10 mg/ml) RNAse 在水中溶解，煮沸五分鐘 . 貯存在 20176。g/ml .蛋白酶 K). ml H2O 40 181。 的原始體積 . 3次 . .吹入 N2 氣體 第 2天 DNA 溶液加到 10毫米氯化鈉 . 到 100毫克 /毫升 ,在 37176。Blin 法修改核質(zhì) . 酸 . 3:2303,1976) 預(yù)先準(zhǔn)備 : 飽和苯酚 ,55℃水浴 ,和 55℃ 20 毫米的 TrisHCl,pH 值 。d to with HCl 10% SDS (or g solid) ~350 ml ddH2O Buffer 25 mM Tris。 pH39。 available from GIBCOBRL PREPARING A PROTEIN GEL: Three basic reagents are required that can be prepared from the list of materials above: (1) acrylamide gel buffers, (2) electrophoresis buffer, and (3) sample loading buffer. 第一步 準(zhǔn)備 ProteinGel Electrophoresis 通常我是采用 20CM 的玻璃盤制備蛋白凝膠 ,偶爾也會使用 Hoffer minigel 系統(tǒng)運(yùn)行制備 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白凝膠通常有兩層 ,最高層是濃縮膠 ,含有 1020% 的凝膠高度 ,濃縮膠中 acylamide 的含量比例比較低 ,一般為%,緩沖液 pH 為 acrylamide,包括剩余的凝膠 ,分離的凝膠 .凝膠分離層中 acrylamide的濃度根據(jù)待分離的樣品不同進(jìn)行設(shè)定 .一般來說 ,所使用的是 815% acrylamide,分離膠的 pH 為 縮膠與分離膠界面的 PH 和膠濃度的差，可以起濃縮 樣本的作用，并且可以提高分離膠的分辨率，使條帶更窄更好看。 in ml eppendorf tubes. Wash the beads 4X with PBST ( % bME optional) and 2X with thrombin cleavage buffer. Stop here if protein bound to beads is needed for binding study. Resuspend the beads in 150 ul thrombin cleavage buffer and add ug thrombin . Incubate at room temperature with mixing for 1 hour. Recover the supernatant containing the fusion protein by centrifugation. Stop the reaction with ul PMSF. Incubate at room temperature 1539。 VII DNA 酶切 1 和 10X buffer 2. III. GST 融合蛋白 細(xì)菌的生 長和收獲 取 100 ul ampicillin 加入到 100 ml LB 中 ,接種 ,過夜生長 . 早上把過夜的肉湯加入到 900 ml 預(yù)溫 LB 中 ,生長一個(gè)小時(shí)或加 . Ampicillin 助于質(zhì)粒生長 .如果需要使用甘油過夜培養(yǎng) ,加入 1 ml IPTG (終濃度為 )到 1L培養(yǎng)液中 ,培養(yǎng) 3~5 小時(shí) ,或在其誘導(dǎo)感應(yīng)前除去 100 ul 細(xì)胞 并加入 100 ul SDSPAGE sample buffer,一過性煮沸 ,取出 10 ul 做 SDSPAGE,數(shù)次沖洗 DNA 碎片 ,可獲得較明顯的帶紋 .每 隔一小時(shí)收集一次樣品以確定誘導(dǎo)的時(shí)間 . 500 ml 離心瓶中加入培養(yǎng)液 ,5K 1039。 ligation 之前 ,微熱 (37 176。 由于 ligase buffer 中的 ATP 不穩(wěn)定，其活性容易隨 著多次冰凍 / 溶解而降低 ,因此你可能需要從最初的tube管吸取 1020 ul ligase 。 Ligase 65176。 C 儲存。 加入適量的宿主載體。 方法 往 mL 無菌 tube中加入適當(dāng)?shù)恼麴s水 加入 1 μ L ligation buffer。 mono ，容易產(chǎn)生質(zhì)粒聚合體，如果過低那麼結(jié)果可能是線的和圓形的 homo 和 heteropolymers。最常見的是用于將插入的 DNA 分子連接到 plasmid ， 并為宿主菌的變形轉(zhuǎn)化做準(zhǔn)備。這一酶素用于連接 DNA 片段鈍性末端或平末端 ,粘性末端。 DNA 連接酶是用于兩個(gè) DNA 分子末端的連接 (包括相同的或不同的 DNA分子 )。旋轉(zhuǎn)穿越只能降低對一個(gè)混合之后殘余的鹽水平，為比較好的解決這個(gè)難題 ,我使用約 300500 μ L PE進(jìn)行兩次洗滌 . 第一次洗滌的時(shí)候 ,我沿著反應(yīng)管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)使沾在加樣槍表面的反應(yīng)液脫落到反應(yīng)管中。 鹽的污染可能來自起始階段的溶菌過程，或是使用 PB洗脫對后續(xù)反應(yīng)不良影響通常會比 EB提高 20%(小劑量的 10 mM Tris 對樣品 DNA序列反應(yīng)的影響是可以忽略的 )。我們可以使用室溫水來獲得比較好的 產(chǎn)品，使用 Knight lab 去離子水洗脫也可以獲得比較好的產(chǎn)品。 Notes 如果你同時(shí)做較多的超過 ~10 minipreps ，能大大節(jié)省將樣品裝載、卸載進(jìn)離心分離機(jī)后，轉(zhuǎn)換成 vacuum manifold version 的時(shí)間。在某些情況下，這樣可以有效提高樣品中 DNA 的濃度。關(guān)于這一步的操作，他們的做法是正確的。 加入 ml 的 Buffer PE 沖洗 QIAprep spin column ，離心 30 ~60 s。這一步驟可以消除 nuclease 酶 活性。就會形成一個(gè)壓的白色圓球。 不允許 lysis反應(yīng)超過 5min 。 加入 250 μ l Buffer P2 并且顛倒 tube 46 次混勻。而純化洗凈低拷貝的 plasmids 、 cosmids ，大分子 plasmids(10 kb) 和 DNA制備使用其他的方法 ,在第 37 頁上表示推薦 . 在第 19 頁 21 上在開始之前仔細(xì)請讀 重要前言 。 如果你以前從未做這個(gè)記錄 , 在手冊中讀背景數(shù)據(jù)。 取 1050 μ l菌液在 100 μ g/ml spectinomycin 預(yù)熱的 LB agar 平板上培養(yǎng)， 37176。 chemicallypetent E，小心混勻 . 冰上孵育 5 到 30 分鐘。 轉(zhuǎn)換 Shot174。對于 electroporation ，稀釋 4fold 鹽溶液。 結(jié)束 PCR 過程。 entry clone Invitrogen TOPO TA cloning kit 以下程序是供有經(jīng)驗(yàn)的 TOPO174。 也，在這個(gè)步驟期間，并加入終止劑終止 Taq DNA Polymerase 活性。 對于模板 DNA 小于 10 ，循環(huán)次數(shù)一般為 40 個(gè)。 C 。此外 , 可用 dGTP 7 deaza 替代反應(yīng)體系中的 dGTP，從而降低 PCR 產(chǎn)品的熔化溫度。如果擴(kuò)增得到的 DNA GC 含量比較高 ,變性時(shí)間要適當(dāng)延長到 34mi。 C 變性 時(shí)間沒有達(dá)到 3min， Taq DNA 聚合酶錯(cuò)配的幾率增加。如果 GC 的含量是 50%，開始變性的溫度定為 95 176。 C) 。 Taq DNA 聚合酶 u Taq DNA Polymerase 常用于反應(yīng) 50 μ l 混合體系中 。 C，因此必須適當(dāng)選擇 GC的含量比例及長度 ； dNTPs 反應(yīng)混合體系中的 dNTP 的濃度通常是 200μ M. 它要求反應(yīng)體系中每一 dNTP(dATP 、 dCTP 、 dGTP,dTTP) 的濃度均相同 , 如果某一種 dNTP 的濃度不平衡增加反應(yīng)時(shí)將會大大增加 DNA 聚合酶錯(cuò)配機(jī)率。 金額上限模板脫氧核糖核酸通常增加出產(chǎn)量未指明的 PCR產(chǎn)品，但， 如果綜合的保真度是關(guān)鍵的，應(yīng)