標(biāo)記免疫技術(shù)(文件)
【正文】 基本特點： ①標(biāo)記后保留酶和抗原 (抗體 )的活性 ②酶促反應(yīng)專一性，保證特異性 ③底物反應(yīng)放大作用，提高敏感性 ④酶標(biāo)試劑保存穩(wěn)定 ⑤操作簡便，安全易行 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 主要試劑的制備與要求 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 一、酶與酶作用底物 （一）用于標(biāo)記酶的要求： ? 酶活性高 ? 標(biāo)記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性 ? 酶催化底物后信號易判定或測定 ? 酶活性不受樣品中其他成分的影響 ? 酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無害，價廉 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 （二）常用酶及其底物 （ HRP） 常用底物： ? 鄰苯二胺（ OPD）：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性 ? 四甲基聯(lián)苯胺（ TMB）：反應(yīng)后呈藍色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。如戊二醛交聯(lián)法。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 ? 固相載體的種類與選擇 材料經(jīng)濟，操作簡便，易于自動化，最常用。 一般采用偏堿性（ ）的碳酸鹽溶液（ ELISA板）。 液相 EIA：分離劑分離游離的和結(jié)合的標(biāo)記物。 ? 加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 ELISA技術(shù)類型： ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，在這種測定方法中有 3種必要的試劑： ?固相的抗原或抗體， ?酶標(biāo)記的抗原或抗體， ?酶作用的底物。 ? 反應(yīng)后，結(jié)合與固相載體上復(fù)合物中被測定的酶標(biāo) Ag（ Ab）的量（酶活性）與樣品中非標(biāo)記Ag（ Ab）的濃度成反比。 類型：免疫滲濾試驗：穿流形式 免疫層析試驗：橫流形式 斑點酶免疫吸附試驗（ dotELISA） 免疫印跡法 (Western blot) 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 免疫印跡法（ immunoblottingtest， IBT） 亦被稱為 Western blot 分三個階段進行 : ? SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE） ? 電轉(zhuǎn)移 ? 酶免疫定位 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 ?SDSPAGE 抗原等蛋白樣品經(jīng) SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽泳動，分子量越小，泳動速度就越快。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù) SDAPAGE加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。 ? 非肽類激素如 T T 雌激素 、 皮質(zhì)醇等 。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 ? 親和素 是一種糖蛋白，可以和 4個生物素分子親密結(jié)合。末端羧基可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 橋聯(lián)法 ABCELISA（ avidinbiotinplexELISA）夾心法測抗原的過程 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實驗研究的各個領(lǐng)域，既可用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。由于 1個親和素分子有4個生物素分子 的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。 ? 生物素 （ biotin）。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 ABCELISA (應(yīng)用親和素和生物素的ELISA) 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 生物素 親合素系統(tǒng) (biotinavidin system， BAS)，是 70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。 病毒如肝炎病毒 、風(fēng)疹病毒 、 皰疹病毒 、 輪狀病毒等；細菌如鏈球菌 、 結(jié)核分枝桿菌 、 幽門螺桿菌和布氏桿菌等；寄生蟲如弓形體 、 阿米巴 、 瘧原蟲等 。此分階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。 基本原理： 固相抗 IgM 待檢標(biāo)本 (IgM) 抗原 (與特異抗體結(jié)合 ) E 酶標(biāo)抗體 底物 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 第三節(jié) 膜載體的酶免疫測定 固相膜免疫測定與 ELISA相類似 ,其特點是以微孔膜作為固相 .標(biāo)記物可用酶和各種有色微粒子 ,如彩色乳膠、膠體金等。 ? 酶標(biāo) Ag（ Ab）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記 Ag（ Ab）具有相同的與固相 Ab(Ag)結(jié)合的能力。如 ELISA。 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗 來自 庫下載 酶免疫技術(shù)的分類 酶免疫組化 用于檢測組織切片或細胞涂片中的抗原和抗體 酶免疫技術(shù) 均相酶免疫測定 酶免疫測定 固相酶免疫測定 異相酶免疫測定 （ ELISA） 液相酶免疫測定
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