細(xì)胞工程-動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)與原理-wenkub
2023-02-13 16:46:40 本頁(yè)面
【正文】 能力的細(xì)胞，可以繼續(xù)不斷地分裂，如骨髓干細(xì)胞、各類(lèi)前體細(xì)胞； 第二類(lèi)細(xì)胞群是永久失去分裂能力的細(xì)胞，如各類(lèi)高度特化的細(xì)胞； 第三類(lèi)是靜止細(xì)胞群，即所謂的G0細(xì)胞，在正常情況下，它們不分裂，也不合成 DNA，但在受到刺激后，則重新進(jìn)入細(xì)胞分裂。 體外受精 ： 加快農(nóng)畜良種化。 生產(chǎn)各種 免疫疫苗 。 包括三個(gè)層面：器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng) 分別代表細(xì)胞水平、組織水平或器官水平的培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的主要領(lǐng)域及意義 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生存條件 主要講 3方面問(wèn)題： 一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的主要領(lǐng)域及意義 單克隆抗體與現(xiàn)代醫(yī)學(xué) 動(dòng)物胚胎孵育與畜牧業(yè) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與現(xiàn)代醫(yī)藥業(yè) 動(dòng)物克隆的廣泛應(yīng)用 單克隆抗體技術(shù)步驟： * 骨髓瘤細(xì)胞 (myeloma cell) 特定抗原免疫刺激的 B淋巴細(xì)胞 (antigen stimulated B lymphoblast)融合 雜交瘤細(xì)胞 (hybridoma cell)。 雜交瘤細(xì)胞的特性： * 既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖，又具有 B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。 用于某些 腫瘤的治療 。 利用體外受精技術(shù)進(jìn)行核移 植、性別控制和基因?qū)耄S化生產(chǎn)遺傳性狀穩(wěn)定、生 產(chǎn)性能優(yōu)良的家畜。如人的肝臟細(xì)胞等。細(xì)胞群常連接成網(wǎng)，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀或火焰狀。 多形性細(xì)胞型 某些組織和細(xì)胞， 如神經(jīng)細(xì)胞，難以確定它們的穩(wěn) 定形態(tài)，可統(tǒng)歸于多形細(xì)胞型。 4. 培養(yǎng)條件下動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn) 1）動(dòng)物細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng) 動(dòng)物細(xì)胞分裂周期一般為 12～ 48小時(shí)，它不僅隨細(xì)胞種屬的不同而有差異，即使是同一種屬，不同部位的細(xì)胞所需的時(shí)間也不同。 3）有限細(xì)胞系和永久細(xì)胞系 動(dòng)物細(xì)胞離體培養(yǎng)起始物 原代培養(yǎng) （ primary culture） 經(jīng)繼代培養(yǎng)后即成為 有限細(xì)胞系 (finite cell line)。人胚成纖維細(xì)胞約可以培養(yǎng) 50代，而成年人的成纖維細(xì)胞則不能繼代 50次，同樣是成纖維細(xì)胞，取自雞胚的成纖維細(xì)胞可繼代培養(yǎng) 30代，而小鼠的只能培養(yǎng) 8代。永久細(xì)胞系的建立是動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的前體 。 三、動(dòng)物細(xì)胞的環(huán)境要求 1. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求 1）無(wú)污染環(huán)境 2）溫度 昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)溫度一般是 25～ 28℃ 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溫度一般是 37℃ 。 3） pH 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的 pH一般在 ，低于 或高于 ，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 5）滲透壓 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)滲透壓包括兩個(gè)方面的問(wèn)題： 培養(yǎng)基的滲透壓維持 細(xì)胞體內(nèi)的滲透壓維持 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)滲透壓的忍耐程度較強(qiáng)，只要培養(yǎng)基的滲透壓變化不是很劇烈，一般對(duì)培養(yǎng)物不會(huì)造成致命傷害。原代培養(yǎng)的細(xì)胞大約增殖 10代左右，稱(chēng)為原代細(xì)胞。 取材前要對(duì)所取組織的各種情況進(jìn)行詳細(xì)記錄； 所用器皿用前嚴(yán)格消毒滅菌，取材時(shí)嚴(yán)格無(wú)菌操作。 常用消化液適用范圍 （ 1） 胰蛋白酶： 適用于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚 胎、羊膜、上皮、肝、腎、傳代細(xì)胞等。根據(jù)效果可中間更換消 化液。 （ 2）膠原酶消化 (collagenase enzymatic digestion ) ① 培養(yǎng)瓶中放入 1~5mm3大小的碎組織塊，加 5ml 2023 u/ml的膠原酶溶液，使終濃度為 200u/ml， ； ② ℃ 水浴 24~48h，視情況可適當(dāng)延長(zhǎng)，無(wú)需搖動(dòng)。一團(tuán)細(xì)胞按一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。 懸滴培養(yǎng)法 (drop culture)——最簡(jiǎn)單、最原始的培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法缺點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)空間狹小氣體不足，不能持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)培養(yǎng)基易液化，需要常更新培養(yǎng)基凹玻片折光，不便于觀察。 卡氏瓶培養(yǎng)法 卡氏瓶 (carlsberg39。 ③用預(yù)先潤(rùn)濕的滴管轉(zhuǎn)移到消毒離心管，靜置使組織小塊下沉，吸去上清。加入1ml生長(zhǎng)培養(yǎng)液，輕斜擺動(dòng)培養(yǎng)皿，使組織小塊均勻分布。 ⑥取出中央組織塊，用預(yù)先濕潤(rùn)的滴管移到另一新的培養(yǎng)瓶。 （二）單層細(xì)胞培養(yǎng)法 ( monolayer method) 組織塊經(jīng)胰酶消化分散成較小的細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，在合成培 養(yǎng)液中附在瓶壁上長(zhǎng)成單層，即形成所謂單層細(xì)胞培養(yǎng)。如單用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液。細(xì)胞自組織塊邊緣向外長(zhǎng)出，最后連接成片，形成單層細(xì)胞。 ②加入 1~2ml培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打，使組織塊懸浮。 （四）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法 (suspended cell culture) 利用旋轉(zhuǎn)、振搖或攪拌的方法不讓細(xì)胞貼壁，使其在培養(yǎng)液中 呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。 （七）中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)法 (hollow fiber cell culture) 模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用人工的“毛細(xì)血管” —— 中空纖維來(lái)供給細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)等條件 細(xì)胞向三維空間生長(zhǎng)繁殖，形成類(lèi)似組織的多層細(xì)胞群體，細(xì)胞 密度可達(dá) 109個(gè) /ml 。 細(xì)胞系： *指從原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代培養(yǎng)后得來(lái)的一群特征專(zhuān)一、類(lèi) 型均勻的細(xì)胞，可以長(zhǎng)期連續(xù)傳代。吸
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