【正文】 足夠大量的標本（擬取 50例標本）作為建庫的 mRNA的來源。 什么是關(guān)鍵問題 ？ 研究過程中對達預期目標有重要影響的某些研究 內(nèi)容或因素。 三、研究方案 研究目標 撰寫要求： 有限目標 ， 與研究內(nèi)容相呼應 如：明確 …… 關(guān)系，揭示 …… 規(guī)律， 闡明 …… 原理（機制），建立 …… 方法等 舉例 ：篩選出與老年性白內(nèi)障相關(guān)的基因，明確部分基因在白內(nèi)障形成中的作用，從晶狀體上皮變化的角度闡明白內(nèi)障的發(fā)生機理，為防治白內(nèi)障提供線索。 本項目從晶狀體上皮細胞入手，利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)研究與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用對體外培養(yǎng)細胞和在體晶狀體上皮細胞的基因轉(zhuǎn)染，探討它們在晶狀體上皮細胞變化和白內(nèi)障形成中的作用，可望闡明白內(nèi)障晶狀體上皮細胞變化的分子生物學機制，為防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。 基因芯片是在 1996年被提出并開始研制的，該技術(shù)是將成千上萬的 DNA探針集中到 1厘米見方的基片上，利用堿基互補原理， DNA探針中的已知堿基序列與被測定的未知 DNA分子雜交后由標記分子標記雜交體，經(jīng)自動閱讀設備分析雜交結(jié)果，從而 對檢測基因進行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，確定未知DNA分子。 我校生化教研室 建立了改良消減雜交技術(shù) [19， 20]，其特點是： 簡便易行，能夠獲得目的細胞特異表達的全長基因，對低豐度基因也能有效分離。 上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，但由于當時技術(shù)條件的限制都未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。 三是對人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。 波形纖維蛋白基因（ vimentin）、雜交的 Ⅲ 型中間纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出白內(nèi)障，而且有隨小鼠年齡增加白內(nèi)障加重的趨勢。 目前，國內(nèi)外對白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要以下三方面： 一是對體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮細胞的研究。 因此，從晶狀體上皮細胞的變化入手探討白內(nèi)障的成因，有可能抓住揭示白內(nèi)障發(fā)病機理的主要環(huán)節(jié)。 就研究的部位分， 晶狀體中皮質(zhì)與核的蛋白質(zhì)改變及晶狀體纖維的改變與白內(nèi)障的形成有關(guān)，而位于晶狀體前囊膜下單層的 晶狀體上皮細胞 在白內(nèi)障的形成中的變化更引人關(guān)注。 E、提出本項目的研究設想。 成熟的方法 重點介紹可以應用于本研究的理論依據(jù)和實驗依據(jù)。 A、從領域切入， 簡要論述 國內(nèi)外研究 成果 ，并引 出當前的熱點研究方向。 B、文獻復習不全： 檢索文獻方法不當、選擇關(guān)鍵詞 不妥，甚至人為縮小檢索范圍。 多年以來許多學者的研究結(jié)果證實晶狀體上皮細胞在老年性白內(nèi)障發(fā)生中起重要的作用，但對其中進一步的基因調(diào)控知之甚少。 雖然手術(shù)后患者可以恢復良好的視力，但是不可避免的 術(shù)后并發(fā)癥以及手術(shù)設備、材料耗資巨大，治療白內(nèi)障 所花費的資金已成為世界各國包括富裕的發(fā)達國家嚴重 的醫(yī)療負擔。 老年性白內(nèi)障 是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的增 加，其發(fā)病比率也不斷升高。 通過基因轉(zhuǎn)染在體和培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞， 觀察細胞的形態(tài)、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶狀體蛋白的變化，研究基因的功能。 基金申請技巧講座 第四軍醫(yī)大學科研部 蘇景寬 第一部分 如何撰寫申請書 一、摘 要（限 400字） 包括：研究方法、內(nèi)容、目標、科學意義。從晶狀體上皮細胞的角度闡明老年性白內(nèi)障發(fā)生的分子生物學機制， 為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。特別是人類趨向老齡化， 白內(nèi)障的患病人數(shù)還將持續(xù)增加。最近的調(diào)查表明，如果把老年性白內(nèi)障的 發(fā)病時間延緩 10年，白內(nèi)障手術(shù)的數(shù)量就會減少 45%[1]。如果從參與老年性白內(nèi)障 晶狀體上皮細胞變化的相關(guān)基因 入手，研究基因的生物學功能，有可能抓住引起白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。 C、總結(jié)表達不夠： 對國內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏歸納分析， 只是簡單羅列，缺乏邏輯性和針對性。 B、從研究方向展開， 較詳細地分析 國內(nèi)外的研究 進展 ，闡明在該方向上存在的問題。 新方法在詳細介紹其原理的基礎上 ，闡明可以應用于本研究的理論依據(jù)和實驗依據(jù)。 防治白內(nèi)障必須針對其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。 因為 晶狀體上皮細胞 是晶狀體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對穩(wěn)定的細胞，它們分裂、分化出晶狀體纖維細胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對稱的結(jié)構(gòu)，對維持晶狀體的透明起重要作用。而 晶狀體上皮細胞變化的基因調(diào)控機制 是問題的關(guān)鍵所在，也是有待我們深入研究的問題。 UVB輻射作用誘導的白內(nèi)障中晶狀體上皮細胞是主要的靶細胞，其 NaKATP酶的活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細胞的凋亡增加，其中有 cfos基因的表達增加；還有組蛋白 H H3 的低表達 `和蛋白酶 C、β肌動蛋白、 γ肌動蛋白基因的高表達 [912]。晶狀體改變的共同特點是晶狀體纖維細胞分化受抑制 [14,15]。 Lee[17]利用 RTPCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細胞中纖維連接蛋白、 I型膠原纖維、 α平滑肌蛋白、TGFβ TGFβ TGFβⅡ 型受體、結(jié)締組織生長因子的基因表達有差異。 尋找白內(nèi)障時晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間 差異表達的基因 有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機理。 該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基因，其中 5個為新基因。 由于目前尚沒有針對白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達的所有基因建立 cDNA文庫，再利用基因芯片技術(shù) 制備成基因芯片 ，以此 檢測多個樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因， 從中 進一步篩選出白內(nèi)障特異的基因 ，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。 參考文獻 A、文獻類別要全 ：以英文文獻為主，同時也要引用 中文文獻 國內(nèi)同行中知名專家的文獻。 研究內(nèi)容： 存在問題： 內(nèi)容過多，一個研究周期難以完成