【正文】 zard 微型柱。 3. 沉淀 DNA 通常使用冰乙醇 ,在低溫條件下放置時(shí)間稍長(zhǎng)可使 DNA 沉淀完全。 吸除上清液 ,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡 ,真空干燥 10 分鐘或室溫干燥。 加入 150μl預(yù)冷的溶液 Ⅲ ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩 10 秒 ,使沉淀混勻 ,冰浴中 510分鐘 ,4℃ 下 12020g 離心 510 分鐘。 （二）、 堿法 取 培養(yǎng)液倒入 eppendorf 管中 ,4℃ 下 12020g 離心 30 秒。 [注意 ] 1. 對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒 DNA。 將 eppendorf 管放入沸水浴中 ,50 秒后立即取出。 （一）、煮沸法 將 培養(yǎng)液倒入 eppendorf 管中 ,4℃ 下 12020ｇ離心 30 秒。 第三節(jié) 操作步驟 一、 細(xì)菌的培養(yǎng)和收集 將含有質(zhì)粒 pBS的 DH5α菌種接種在 LB 固體培養(yǎng)基 (含 50μg/ml Amp)中 , 37℃ 培養(yǎng) 1224 小時(shí)。 1 STE： ， 10mmol/L TrisCl ()， 1 mmol/L EDTA ()。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開(kāi) ,異戊醇則可起消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫。重蒸酚加入 ％的 8羥基喹啉 (作為抗氧化劑 ),并用等體積的 RNA 酶 A 母液：將 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris 溶液Ⅰ 可成批配制 ,每瓶 100ml,高壓滅菌 15 分鐘 ,儲(chǔ)存于 4℃ 冰箱。Cl()溶液配制成 10mg/ml,并分裝成小份 (如 )保存于 20℃ ,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。 三、試劑 LB 液體培養(yǎng)基 (LuriaBertani) ：稱(chēng)取蛋白胨 (Tryptone)10 g，酵母提取物 (Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于 800ml 去離子水中，用 NaOH 調(diào) pH 至 , 加去離子水至總體積 1 升 ,高壓下蒸氣滅菌 20 分鐘。如果質(zhì)粒 DNA 兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂 ,分子就能旋 轉(zhuǎn)而消除鏈的張力 ,形成松馳型的環(huán)狀分子 ,稱(chēng)開(kāi)環(huán) DNA(Open circular DNA, 簡(jiǎn)稱(chēng) ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA 的兩條鏈在同一處斷裂 ,則形成線(xiàn)狀 DNA(Linear DNA)。經(jīng)溶菌酶和 SDS 或 Triton X100 處理后 ,細(xì)菌染色體 DNA 會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上 ,同時(shí)由于細(xì)菌染色體 DNA 比質(zhì)粒大得多 ,易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線(xiàn)性片段。常用的質(zhì)粒載體大小一般在 1kb 至 10kb 之間，如 PBR32 PUC 系列、 PGEM 系列和 pBluescript（簡(jiǎn)稱(chēng) pBS）等。 質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。 利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在 ,當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí) ,它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過(guò)程中彼此競(jìng)爭(zhēng) ,在一些細(xì)胞中 ,一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì) ,而在另一些細(xì)胞 中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。 質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類(lèi)型 :緊密控制型 (Stringent control)和松馳控制型 (Relaxed control)。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線(xiàn)菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力 ,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù) ,并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。 1 第一章 質(zhì)粒 DNA 的分離、純化和鑒定 第一節(jié) 概 述 把一個(gè)有用的目的 DNA 片段通過(guò)重組 DNA 技術(shù) ,送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體 (Vector)。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴(lài)于宿主細(xì)胞編碼的某 些酶和蛋白質(zhì)，如離開(kāi)宿主細(xì)胞則不能存活 ,而宿主即使沒(méi)有它們也可以正常存活。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制 ,當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí) ,它也不能復(fù)制 ,通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有 1 個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子 ,如 F 因子。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)幾代后 ,占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失 ,因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱(chēng)質(zhì)粒的不相容性 (Inpatibility)。與天然質(zhì)粒相比 ,質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因 (如抗生素抗性基因 )和一 個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列 ,并去掉了大部分非必需序列 ,使分子量盡可能減少 ,以便于基因工程操作。 從細(xì)菌中分離質(zhì)粒 DNA 的方法都包括 3 個(gè)基本步驟 :培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞 。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處 理時(shí)，細(xì)菌的線(xiàn)性染色體 DNA 變性 ,而共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA(Covalently closed circular DNA，簡(jiǎn)稱(chēng) cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開(kāi)，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線(xiàn)狀染色體 2 DNA 片段難以復(fù)性 ,而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起 ,而質(zhì)粒 DNA 雙鏈又恢復(fù)原狀 ,重新形成天然的超螺旋分子 ,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。當(dāng)提取的質(zhì)粒 DNA 電泳時(shí) ,同一質(zhì)粒DNA 其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線(xiàn)狀分子的泳動(dòng)速度快。 LB 固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加 12g 瓊脂粉 ,高壓滅菌。 3mol/l NaAc ()： 50ml 水中溶解 NaAc 溶液 Ⅱ ： mol/L NaOH (臨用前用 10mol/L NaOH 母液稀釋 )， 1％ SDS。Cl(), 15mmol/L NaCl 中 ,配成 10mg/ml的溶液 ,于 100℃ 加熱 15 分鐘 ,使混有的 DNA 酶失活。Cl ()和 按體積 /體積＝ 1:1 混合上述飽和酚與氯仿即得酚 /氯仿 (1:1)。高壓滅菌后儲(chǔ)存于 4℃ 3 冰箱中。Cl()， 1mmol/L EDTA ()。用無(wú)菌牙簽挑取單菌落接種到 5ml LB 液體培養(yǎng)基 (含 50μg/ml Amp)中 ,37℃ 振蕩培養(yǎng)約 12 小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。 棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。 用微量離心機(jī) 4℃ 下 12020g 離心 10 分鐘。 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度 ,濃度高時(shí) ,細(xì)菌裂解效果反而不好。 棄上清 ,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘 ,使液體流盡。 上清液移入干凈 eppendorf 管中 ,加入等體積的酚 /氯仿 (1:1),振蕩混勻 ,4℃ 下 12020g 離心 5 分鐘。 將沉淀溶于 20μl TE緩沖液 (，含 20μg /ml RNaseA)中，儲(chǔ)于 20℃ 冰箱中。沉淀 DNA 也可用異丙醇 (一般使用等體積 ),且沉淀完全 ,速度快 ,但常把鹽沉淀下來(lái) ,所以多數(shù)還是用乙醇。 13ml 過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞液 4℃ 下 12020g 離心 12 分鐘。 4℃ 下 12020g 離心 5 分鐘，取上清液于新的 eppendorf 管中。 取出微型柱 置于 eppendorf 管中 ,離心 2 分鐘以除去微型柱中的柱洗液。 三、質(zhì)粒 DNA 的大量提取和純化 在制作酶譜、測(cè)定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒 DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒 DNA。 5 同步驟 1 方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。 4℃ 下 5000g 離心 15 分鐘。 1取上層水相 ,加入 1/5 體積的 4mol/L NaCl 和 10% PEG(分子量 6000), 冰上放置 60 分鐘。 2. 加入溶液 II 和溶液 III 后操作應(yīng)混和 ,切忌劇烈振蕩。 該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可以用于 10 次 100500ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化 ,試劑包括 : 150ml 細(xì)胞懸浮液， 150ml 細(xì)胞裂解液， 150ml 中和液， 100ml Wizard 大量 DNA 純化樹(shù)脂， 125ml Wizard柱子洗脫溶液和 10 支 Wizard 帶有存儲(chǔ)離心管的柱子。 14000g,2225℃ 離心 15 分鐘。這一步中也許有的沉淀不能溶解。 1將樹(shù)脂 /DNA 混合液抽干后 ,加 13ml 柱子洗脫溶液至離心管中 , 對(duì)管底部的樹(shù)脂 /DNA 進(jìn)行 6 洗脫 (柱子一邊旋轉(zhuǎn)一邊加入洗脫液 )，并加入柱子中。 1 取出柱子，真空抽干 5 分鐘 ,再將柱子放入系統(tǒng)中所提供的離心管中， 2500rpm(1300g)離心 5 分鐘。 2. 純化樹(shù)脂必須混勻后再用 . （三）、 Sephrose 2B 柱純化質(zhì)粒 DNA 堿法提取的質(zhì)粒 DNA 即使用 RNA 酶處 理 ,仍會(huì)含有少量 RNA。 將至多 1ml 的 DNA 溶液鋪在 Sepharase 2B 柱上。通常質(zhì)粒 DNA 在柱上流出的第一個(gè)峰中。 沉淀真空抽干 ,重新溶于 TE 或無(wú)菌水中。 它可分為三類(lèi) :Ⅰ 類(lèi)和 Ⅲ 類(lèi)酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾 (甲基化 )作用且依賴(lài)于 ATP 的存在。 Ⅱ 類(lèi)中的限制性?xún)?nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組 DNA 的基礎(chǔ)。 Ⅱ 類(lèi)酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中 ,有的在對(duì)稱(chēng)軸處切割 ,產(chǎn)生平末端的 DNA 片段 (如 SmaⅠ :539。 539。 339。 DNA 純度、緩沖液、溫度條件及限制性?xún)?nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性?xún)?nèi)切酶的活性 。若兩者可用同一緩沖液 ,則可同時(shí)水解。在 DNA 序列分析、基因組的功能圖譜繪制、 DNA 的無(wú)性繁殖、基因文庫(kù)的構(gòu)建等工作中，建立限制性?xún)?nèi)切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié)，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 )技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。 在酶切圖譜制作過(guò)程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般 DNA 用量約為 。 二 . 凝膠電泳 瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒 定和純化 DNA 片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。 瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快 ,可容納相對(duì)大量的 DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。在電場(chǎng)中 ,在中性 pH 值下帶負(fù)電荷的 DNA 向陽(yáng)極遷移 ,其遷移速率由下列多種因素決定 : DNA 的分子大小 : 線(xiàn)狀雙鏈 DNA 分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與 DNA 分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。分離小于 的DNA 片段所需膠濃度是 %,分離大于 10kb 的 DNA 分子所需膠濃度為 %, DNA 片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為 %。 電源電 壓 在低電壓時(shí) ,線(xiàn)狀 DNA 片段的遷移速率與所加電壓成正比。 離子強(qiáng) 度影響 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響 DNA 的電泳遷移率。 重組 pBS 質(zhì)料或 pUC19 質(zhì)粒 。 二、 設(shè)備 水平式電泳裝置 ,電泳儀 ,臺(tái)式高速離心機(jī) , 恒溫水浴鍋 , 微量移液槍 , 微波爐或電爐 ,紫外透射儀 , 照相支架 , 照相機(jī)及其附件。 第三節(jié) 操作步驟 一、 DNA 酶切反應(yīng) 將清潔干燥并經(jīng)滅菌的 eppendorf 管 (最好 )編號(hào) ,用微量移液槍分別加入 DNA 1μg和相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng) 10緩沖液 2μl,再加入重蒸水使總體積為 19μl,將管內(nèi)溶液混勻后加入 1μl酶液 ,用手指輕彈管壁使溶液混勻 ,也可用微量離心機(jī)甩一下 ,使溶液集中在管底。 每管加入 2μl (),混勻 ,以停止反應(yīng) ,置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?EcoRI 切割 lDNA 后得到 6 個(gè)片段 ,長(zhǎng)度 分別為 , , , , 和 。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜 ,以減少水份蒸發(fā)。用移液器吸取少量融化的 瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè) ,待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi) ,使膠液形成均勻的膠層。 加樣：取 10μl酶解液與 2μl 6載樣液混勻 ,用微量移液槍小心加入樣品槽中?？刂齐妷罕３衷?6080V,電流在 40mA 以上。DNA 存在處顯示出肉眼 可辨的桔紅色熒光條帶。以核苷酸數(shù)的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo) ,以遷移距離為橫坐標(biāo) ,在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線(xiàn) ,即為該電泳條件下 DNA 分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以環(huán)狀圖或直線(xiàn)圖表示 ,即成該 DNA 分子的限制性?xún)?nèi)切酶圖譜。 市場(chǎng)銷(xiāo)售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見(jiàn)，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（ 1）進(jìn)行稀釋。 EB 是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性 ,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套 ,并且不要把 EB 灑到桌面或地面上。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA。進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA 分子通過(guò)復(fù)制 ,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移 ,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的 OD600 來(lái)控制。 轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比 ,但當(dāng)加入的外源 DNA 的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí) ,轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。 4. 防止雜菌和雜 DNA 的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行 , 所用器皿 , 如離心管 , tip頭等最好是新的 ,并經(jīng)高壓滅菌處理 ,所有的試劑都要 滅菌 ,且注意防止被其