【正文】 、退火階段和延伸階段(在某些情況下，退火階段和延伸階段可以合并)，反應(yīng)時間是以上三個階段的總時間加上各階段間溫度變化的時間。近年來，快速PCR技術(shù)得到了可喜的進(jìn)展。 Molecular beacon技術(shù)　　亦稱分子信標(biāo)技術(shù)是一種單鏈DNA 形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)， 在其一端有一報告基團(tuán)， 在另一端有一淬滅基團(tuán)， 當(dāng)它形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時， 由于熒光報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)想互靠近， 兩者之間發(fā)生熒光信號能量共振轉(zhuǎn)移( fluorescent resonance energy transfer FRET)，當(dāng)熱循環(huán)溫度達(dá)到分子beacon的解鏈溫度時，其構(gòu)象改變，與模板結(jié)合而完全伸展成線性分子，使得FRET消失，報告基團(tuán)發(fā)出熒光信號。端，兩探針能分別與模板同一條鏈中相鄰的核苷酸序列進(jìn)行雜交。 Lightcycler技術(shù)　　Lightcycler技術(shù)是Roche公司新近開發(fā)的一種PCR定量技術(shù)。在PCR擴(kuò)增前需將該復(fù)合探針與一個半套式PCR引物連接，該引物的539。一個探針上標(biāo)以熒光報告基團(tuán)，另一個探針上標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)，后者的539。由此可見，每合成一條新鏈就有一個探針被裂解并釋放出一個熒光信號。在PCR退火復(fù)性期，探針與DNA 模板特異性結(jié)合。當(dāng)探針保持完整時，兩個基團(tuán)的空間距離非常接近，構(gòu)成熒光能量傳遞( FRET) 關(guān)系，539。該探針可與上、下游引物之間的DNA模板序列特異性結(jié)合。 Taqman技術(shù)　　Taqman 技術(shù)由美國PE公司開發(fā)，現(xiàn)已廣泛用于基因檢測。因此，對于競爭性PCR的研究重點(diǎn)主要集中在建立高效、穩(wěn)定、可靠的模板方面，現(xiàn)已取得了較滿意的結(jié)果[1113]。當(dāng)兩模板的產(chǎn)物量相同時，則兩模板的反應(yīng)起始拷貝數(shù)相等，由此可對待測模板進(jìn)行精確定量。競爭性PCR即是采用內(nèi)參照的一種定量PCR方法，通過消除管間及樣品間的變異，從而達(dá)到較為精確的基因定量[10]。這種類型是應(yīng)該提倡的。這種類型對樣本進(jìn)行質(zhì)控監(jiān)測，排除假陰結(jié)果，但是定量不準(zhǔn)。狹義概念的定量PCR技術(shù)（嚴(yán)格意義的定量PCR技術(shù)）是指用外標(biāo)法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測PCR過程（監(jiān)測擴(kuò)增效率）達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時以內(nèi)對照有效排除假陰性結(jié)果(擴(kuò)增效率為零)。尤其是mRNA差異顯示PCR技術(shù)，雖然發(fā)明只有短短十幾年，已經(jīng)取得了令人矚目的科研成果，原因是它具備需要總RNA 的量極少，不需要純化的mRNA，操作簡便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)[58]，故已被許多生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室作為一種重要工具，應(yīng)用于體內(nèi)和體外差異表達(dá)基因的篩選，研究基因功能[9]。從聚合酶的改進(jìn)、添加劑的開發(fā)以及熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造三個不同途徑上分別進(jìn)行的研發(fā)表明。　　隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測的不斷發(fā)展，人們越來越希望在保證PCR反應(yīng)特異性、靈敏性、保真度的同時，能夠盡量縮短反應(yīng)的時間，即實(shí)現(xiàn)快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)?！　￡P(guān)鍵字：定量PCR；熒光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差異顯示PCR　　0 前言　　聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)由于PCR簡便易行、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。但是，由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，且操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點(diǎn)，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制[1]。快速PCR技術(shù)不僅可使樣品在有限的時間內(nèi)可以盡快得到擴(kuò)增，而且可以顯著增加可檢測的樣品數(shù)量，顯然，在大批量樣本檢測和傳染病快速診斷等方面將會有重要的應(yīng)用前景。　　生物的性狀和生物對各種生物、理化及致病因子的應(yīng)答，本質(zhì)上都是基因在時間上或空間上選擇性表達(dá)，即基因的差異表達(dá)的結(jié)果，因而，獲取差異表達(dá)的基因信息，將有助于了解生物的生理變化和病理改變的分子機(jī)制[2]。現(xiàn)將定量PCR技術(shù)、快速PCR技術(shù)、mRNA差異顯示PCR技術(shù)研究情況作一綜述作簡要綜述。廣義概念下的定量PCR技術(shù)可以分為五種類型： 　　（1）外參法+終產(chǎn)物分析，是指樣本與陽性參照在兩個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。 　　（3）外標(biāo)法+過程監(jiān)測，這種類型監(jiān)測擴(kuò)增效率，陽性樣本定量準(zhǔn)，但是無法排除假陰結(jié)果。 競爭性PCR技術(shù)　　定量PCR技術(shù)是對傳統(tǒng)PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和補(bǔ)充，在定量過程中需借助各種形式的參照物。該方法是將待測基因與已知濃度的內(nèi)參照模板在同一反應(yīng)管中共同擴(kuò)增，由于二者具有相同引物的結(jié)合位點(diǎn)并采用同一引物進(jìn)行擴(kuò)增，因此二者競爭引物、脫氧核苷酸以及DNA聚合酶，以致當(dāng)一種模板量逐漸增加時，另一種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物就會逐漸減少。具體檢測方法是將已知濃度的內(nèi)參照模板倍比稀釋后分別與恒定量的待測基因一起擴(kuò)增，以參照模板的起始拷貝數(shù)為橫軸，以兩模板擴(kuò)增產(chǎn)物量的比率為縱軸，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為1的點(diǎn)所對應(yīng)的參照模板的起始拷貝數(shù)即為待測基因的拷貝數(shù)?！?． 2 熒光定量PCR技術(shù)　　熒光定量PCR（RQPCR技術(shù)）是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)的原理是利用Taq 酶的539。探針的539。端熒光報告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號被339。在PCR延伸階段，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，以四種脫氧核苷酸為底物，按堿基配對原則沿著模板合成新鏈，當(dāng)移動至探針結(jié)合的位置時便發(fā)揮其539。根據(jù)這種關(guān)系，通過檢測PCR反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度，再經(jīng)校正計算后即可得出初始模板的數(shù)量。端較前者多出7個堿基( GCGTCCC)。端應(yīng)具有一段與長探針上多出的7個堿基互補(bǔ)的序列，以便DNA連接酶能將該引物與短探針連接。該技術(shù)的特點(diǎn)[18,19]也是將熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別標(biāo)記在兩個不同的探針上，形成熒光探針和淬滅探針。當(dāng)探針游離時能檢測到報告基團(tuán)的熒光信號； 如果反應(yīng)體系中存在特異性模板，PCR復(fù)性階段兩探針即會與之雜交，此時兩探針上的熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相距很近，形成FRET關(guān)系，前者的熒光信號被后者吸收，即發(fā)生熒光淬滅。2 快速PCR技術(shù)　　隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測的不斷發(fā)展，人們越來越希望在保證PCR反應(yīng)特異性、靈敏性、保真度的同時，能夠盡量縮短反應(yīng)的時間，即實(shí)現(xiàn)快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)。從聚合酶的改進(jìn)、添加劑的開發(fā)以及熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造三個不同途徑上分別進(jìn)行的研發(fā)表明，快速PCR技術(shù)不僅對普通擴(kuò)增，且對實(shí)時定量擴(kuò)增都具有可實(shí)現(xiàn)性，并已有相關(guān)的部分試劑或儀器在市場上推出。要實(shí)現(xiàn)快速PCR，其根本問題就是要縮短這三大階段的持續(xù)時間或溫度變化的時間。2． 2 用于實(shí)現(xiàn)快速PCR的DNA聚合酶　　在PCR循環(huán)中，延伸階段的持續(xù)時間主要取決于DNA聚合酶的延伸速率，提高聚合酶的延伸活性和延伸速率無疑會縮短整個PCR反應(yīng)所需的時間。Sso7d是從Sulfolobus solfataricus中分離到的一種雙鏈DNA結(jié)合蛋白[23]。同時，融合后DNA聚合酶與雙鏈DNA的作用是較弱的，這就避免了強(qiáng)相互作用所導(dǎo)致的阻礙DNA聚合酶在DNA鏈上移動的不利結(jié)果。Pavlov等[25]將它與PfuDNA聚合酶相融合后發(fā)現(xiàn)可以增加DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性、提高酶對高鹽濃度的耐受性，并增加酶的延伸活性。在其試驗(yàn)體系中ZOTaq具有最高的反應(yīng)速率，但形成PCR 假象( artifact)的總幾率較高，達(dá)20%；LAOTaq具有最高的保真度，反應(yīng)速率居中，形成PCR假象的總幾率為15%；AmpliTaq形成PCR假象的幾率為7%。3 mRNA 差異顯示PCR技術(shù)3．1 mRNA差異顯示PCR技術(shù)的主要原理　　在生命過程的某一