【正文】 一套保證該菌種能發(fā)揮最大潛在生產(chǎn)能力的工藝過(guò)程，才能獲得發(fā)酵生產(chǎn)的成功。指導(dǎo)教師根據(jù)學(xué)生表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范與否、以及實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)報(bào)告水平等綜合評(píng)定成績(jī)，將其作為課程成績(jī)的重要組成部分，并單獨(dú)記載實(shí)驗(yàn)成績(jī)。 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：將發(fā)酵過(guò)程按工藝流程整合成菌種管理實(shí)驗(yàn)技術(shù)、生物培養(yǎng)工藝過(guò)程實(shí)驗(yàn)技 術(shù)、發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的微生物學(xué)檢測(cè)、生物工藝過(guò)程相關(guān)參數(shù)的檢測(cè)、生物物質(zhì)分離與精制實(shí)驗(yàn)技術(shù)、生物物質(zhì)成分分析實(shí)驗(yàn)技術(shù)培養(yǎng)基配制等單元實(shí)驗(yàn)?zāi)K，屬于發(fā)酵基本實(shí)驗(yàn)技能，作為課程實(shí)驗(yàn)的基本環(huán)節(jié)。 (2)綜合實(shí)驗(yàn) ：指具有綜合度并帶有一定設(shè)計(jì)性的大實(shí)驗(yàn)，是課程實(shí)驗(yàn)的提高環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涵蓋實(shí)際生物產(chǎn)品生產(chǎn)及過(guò)程控制檢測(cè)等內(nèi)容，學(xué)生可以結(jié)合自己的興趣選做其中部分內(nèi)容。 《發(fā)酵綜合實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書》在內(nèi)容上涵蓋了發(fā)酵工程的諸多新領(lǐng)域，與學(xué)科的發(fā)展相適應(yīng)，激發(fā)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣?！栋l(fā)酵綜合實(shí)驗(yàn)》課程作為發(fā)酵工程教學(xué)的重要部分，一直是課程建設(shè)的重點(diǎn)，在實(shí)現(xiàn)學(xué)生總體培養(yǎng)目標(biāo)中占有重要地位。本課程著重培養(yǎng)學(xué)生的專業(yè)核心技能，通過(guò)本課程的開展可以培養(yǎng)學(xué)生對(duì)發(fā)酵等工業(yè)的興趣及將來(lái)從事發(fā)酵生產(chǎn)的能力。實(shí)驗(yàn)安排上，首先通過(guò)精心選擇、安排基本技能訓(xùn)練的 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，做到少而精，便于學(xué)生掌握，而且在進(jìn)一步在綜合實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中，這些基本技能訓(xùn)練重復(fù)出現(xiàn)，基本技能得到了鞏固和加強(qiáng)；其次，以大小、難易等不同項(xiàng)目為教學(xué)單元，增加了綜合性、設(shè)計(jì)性的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。 本講義最主要的特點(diǎn)是以實(shí)踐性環(huán)節(jié)為中心內(nèi)容，只在必要的時(shí)候介紹一些必需的理論知識(shí)；選材方面，注意將國(guó)外該領(lǐng)域的最新實(shí)驗(yàn)技術(shù)與我國(guó)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)材料以及研究方法有機(jī)結(jié)合起來(lái)，所選取的這些實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)是科學(xué)研究工作中經(jīng)常應(yīng)用的技術(shù) ，可操作性強(qiáng)；另外，結(jié)合學(xué)生知識(shí)基礎(chǔ)和學(xué)習(xí)特點(diǎn)以及現(xiàn)有教學(xué)設(shè)備，合理編排內(nèi)容，學(xué)習(xí)起來(lái)更容易，技術(shù)掌握更簡(jiǎn)單，方法更實(shí)用。綜合實(shí)驗(yàn) ：指具有綜合度并帶有一定設(shè)計(jì)性的大實(shí)驗(yàn)，是課程實(shí)驗(yàn)的提高環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涵蓋實(shí)際生物產(chǎn)品生產(chǎn)及過(guò)程控制檢測(cè)等內(nèi)容，學(xué)生可以結(jié)合自己的興趣選做其中部分內(nèi)容。通過(guò)實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)，學(xué)生能強(qiáng)化理論知識(shí)，學(xué)會(huì)綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)解決實(shí)際問(wèn)題，提高專業(yè)核心能力。一般需要根據(jù)需要分離出相應(yīng)的菌種，但野生型菌種產(chǎn)量都比較低，不能直接用于生產(chǎn)，現(xiàn)在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中所使用的菌種，幾乎都是經(jīng)過(guò)人工選育出來(lái)的優(yōu)良菌種。因此可以從土壤中分離到幾乎所有微生物。 自然界的微生物是混雜生存的，要從中分理 出一種微生物，不僅需要考慮分離源應(yīng)含有較多數(shù)量的目的菌，還要在分離操作中使之與其他菌種相互分開。純種 (純培養(yǎng) )是指一株菌種或一個(gè)培養(yǎng)物中所有的細(xì)胞或孢子都是由一個(gè)細(xì)胞分裂，繁殖而產(chǎn)生的后代。 實(shí)驗(yàn)一 厭氧菌的分離和培養(yǎng) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵? 了解厭氧微生物的生長(zhǎng)特性； 觀察厭氧微生物（雙歧桿菌）的形態(tài)特征； 掌握厭氧微生物的滾管分離、培養(yǎng)與計(jì)數(shù)技術(shù)。此后這項(xiàng)技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進(jìn)，從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趨完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一整套完整技術(shù)。 培養(yǎng)基 改良 MRS 培養(yǎng)基， PTYG 培養(yǎng)基。 3H2O） g 硫酸鎂（ MgSO4 改良 MRS 培養(yǎng)基： MRS 培養(yǎng)基中添加促生長(zhǎng)物質(zhì) Y ％，還原劑 B ％。此管的大小為 40—400mm，兩段被加工成漏斗裝，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來(lái)控制電壓和穩(wěn)定銅柱的溫度。此銅柱可以反復(fù)使用，并不斷起到除氧的目的。 雙歧桿菌樣品不同稀釋度的制備 在無(wú)菌條件下準(zhǔn)確稱取 1g 固體或用無(wú)菌注射器吸取 1ml混合均勻的液體樣品，而后加入裝有預(yù)還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其震蕩均勻，制成101 稀釋液。 厭氧滾管培養(yǎng)法 將盛有融化的無(wú)菌無(wú)氧瓊脂培養(yǎng)基試管放置于 50℃左右的恒溫水浴中，用1ml 無(wú)菌注射器分別吸取 10 10 107 三個(gè)稀釋度的稀釋液各 的瓊脂培養(yǎng)基試管中，而后將其平放于盛有冰塊的盤中或特制的滾管機(jī)上迅速滾動(dòng)，這樣帶菌的融化培養(yǎng)基在試管內(nèi)壁立即凝固成一薄層。 計(jì)算 雙歧桿菌的活菌數(shù)量 cfu/g(ml)樣品 = 10稀釋倍數(shù) 六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察雙歧桿菌形態(tài)，描述其形態(tài)特征。 要求：全班每個(gè)同學(xué)都要親自動(dòng)手，以目標(biāo)產(chǎn)物從土壤中分離高產(chǎn)菌株，每人寫1 份研究報(bào)告。運(yùn)用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長(zhǎng)因子的前體物質(zhì)來(lái)激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立若干富集技術(shù)。 采樣： 選 取離地面 5～ 15 cm 處的土。 26℃下皿底朝上培養(yǎng) 4— 10天，將長(zhǎng)出的菌落接入斜面，但應(yīng)挑分離成單個(gè)的，以免不純。取出培養(yǎng)液 5m1 加入試管內(nèi)，加 ，然后加氯化鐵液 2— 3 滴，搖勻，觀察液色是否變?yōu)辄S紅色，如將試管放在火焰上煮沸，有無(wú)紅褐色沉淀生出，根據(jù)所消耗的 NaOH 量確定產(chǎn)物醋酸的具體生成量。在分離培養(yǎng)基（ ）中加入溴酚綠指示劑后呈藍(lán)綠色，乳酸菌在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并分解乳糖，產(chǎn)生乳酸，使菌落呈黃色，菌落周圍的培養(yǎng)基也變?yōu)辄S色， 所以較容易鑒別。 儀器和器具 涂布器，平皿。 （ 3）趁熱將上述兩液以無(wú)菌操作混合均勻，倒平板 6 個(gè)，待凝固后，置 37℃培養(yǎng) 24h，若無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可使用。 （ 1）鏡檢細(xì)胞長(zhǎng)桿狀、革蘭氏染色陽(yáng)性。 ③分析結(jié)果 在層析濾紙上，底板呈現(xiàn)藍(lán)色而有機(jī)酸呈黃色斑點(diǎn)，被測(cè)樣斑點(diǎn)的Rf 值如果與標(biāo)準(zhǔn)乳酸斑點(diǎn)的 Rf 值相等即可確定為乳酸。 179。 七、思考題 為什么溶解樣品的瓶?jī)?nèi)要加入玻璃珠？ 說(shuō)明用透明圈直徑與菌株淀粉酶產(chǎn)量有何關(guān)系？ 哪些情況能夠引起凝乳？ 實(shí)驗(yàn)四 啤酒酵母的分離 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵? 了解啤酒酵母的形態(tài)特征； 學(xué)習(xí)并掌握啤酒酵母菌的分離方法。因此啤酒酵母的性能對(duì)啤酒質(zhì)量是很重要的。在麥芽汁固體培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，不透明，但有光澤，菌落表面光滑、邊緣整齊。 具體配制過(guò)程如下： 取 大麥芽一定數(shù)量，粉碎，加 4 倍于麥芽量的 60℃的水，在 5560℃下，保溫糖化，不斷攪拌，經(jīng) 34 小時(shí)后，用紗布過(guò)濾，除去殘?jiān)?，煮沸后再重?fù)用濾紙或脫脂棉過(guò)濾一次，即得澄清的麥芽汁（每 1000 克麥芽粉能制得 1518 oBrix 麥芽汁 35004000 毫升），加水稀釋10oBrix 至 12 oBrix 的麥芽汁。 四、實(shí)驗(yàn)方法 菌懸液的制備 將啤酒發(fā)酵液以 10 倍稀釋法稀釋至 107，取后三個(gè) 稀釋度的稀釋液各 毫升分別置于無(wú)菌平皿中，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。 性能測(cè)定 對(duì)分離株需做如下測(cè)定： （ 1）啤酒酵母生成子囊孢子的速度； （ 2）啤酒酵母發(fā)酵力的測(cè)定；（見(jiàn)本節(jié)實(shí)驗(yàn)六） （ 3）啤酒酵母熱死溫度的測(cè)定；（見(jiàn)本節(jié)實(shí)驗(yàn)七） （ 4）啤酒酵母凝聚力的測(cè)定；（見(jiàn)本節(jié)實(shí)驗(yàn)八） （ 5）同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液及成品酒的雙乙酰含量，通過(guò)對(duì)比，最后選擇優(yōu)良菌株投入生產(chǎn)。 六、思考題 影響啤酒質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)是什么？ 實(shí)驗(yàn)五 檸檬酸產(chǎn)生菌的分離 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵? 了解黑曲霉在工業(yè)生產(chǎn)中的不同作用； 學(xué)習(xí)并掌握黑曲霉的分離原理及方法。利用其產(chǎn)酸高、耐酸強(qiáng)的生理特征，使用 的酸性營(yíng)養(yǎng)濾紙分離該菌，簡(jiǎn)單易行。（見(jiàn)附錄） 試劑和器具 Deniges 氏液， 2％高錳酸鉀溶液， ， 1％酚酞指 示劑，平皿（內(nèi)放濾紙于皿底， 3 張直徑 8 厘米）干熱滅菌，三角瓶，吸管。 用接種挑取分生孢子接于察氏培養(yǎng)基斜面， 25℃培養(yǎng) 2－ 3 天。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 描述產(chǎn)檸檬酸黑曲霉的菌學(xué)特征。正常的啤酒酵母能發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽三糖等。（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)四或附錄） 試劑和器具 發(fā)酵瓶、發(fā)酵栓、比重瓶、恒溫水浴、燒瓶、冷凝器。 發(fā)酵度的測(cè)定 （ 1）原麥汁濃度的測(cè)定（用附溫比重瓶法）將附溫比重瓶用洗液浸泡，取出后徹底洗滌為中性，再用乙醇、乙醚順序洗滌數(shù)次，吹干后準(zhǔn)確稱量（用分析天平），此數(shù)據(jù)為 W1，即比重瓶的重量。那么樣品（即過(guò)濾麥汁）的比重 D2020 可以由下式表示： D2020 =（ W2－W1） /（ W3－ W1），即 20℃樣品與同體積 20℃水的重量之比值。 （ 3）真正濃度的測(cè)定（用 n表示） 取一蒸餾燒瓶，向其中加入 100g 除去氣體并經(jīng)過(guò)過(guò)濾的發(fā)酵液， 80℃左右蒸出其中的酒精，待蒸出三分之二時(shí)， 自然冷卻，稱量。 100% 真正發(fā)酵度 = 原麥汁濃度 餾后的真濃度原麥汁濃度－發(fā)酵液蒸 179。再將一個(gè)已知重量的 100mL 容量瓶浸入冰水中，接收蒸出的蒸餾液。 100% 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以產(chǎn)生二氧化碳的量為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制發(fā)酵速率曲線。 二、實(shí)驗(yàn)原理 熱死溫度是指液態(tài)培養(yǎng)的微生物，在某溫度下 10 分鐘即被殺死，此溫度稱為微生物的熱死溫度。在啤酒廠所選擇的溫度為 4060℃。（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)四或附錄） 儀器和器具 恒溫水浴箱、恒溫箱、無(wú)菌移液管、計(jì)時(shí)表、溫度計(jì)、酒精燈、酒精棉球。但通常情況下，則以此測(cè)得的最低溫度加 12℃為該酵母的熱死溫度。 六、思考題 什么是熱死溫度？酵母的熱死溫度的影響因素有哪些？ 若酵母的熱死溫度發(fā)生改變，則引起的原因是什么？ 實(shí)驗(yàn)八 酵母菌凝集力的測(cè)定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵? 了解酵母菌凝集力的測(cè)定原理與應(yīng)用； 學(xué)習(xí)酵母菌凝集力測(cè)定的操作技術(shù)。 培養(yǎng)基 麥芽汁培養(yǎng)基。在 20℃水浴中靜置 20 分鐘，再將此懸液連續(xù)搖動(dòng) 5 分鐘，使酵母重新懸浮，再靜置，在 20 分鐘內(nèi)每分鐘記錄一次沉淀酵母菌的容積。 六、思考題 酵母菌的凝集性在生產(chǎn)上的特殊重要性是什么？ 若酵母的凝集性發(fā)生改變，則引起的原因是什么？ 第二節(jié) 微生物育種 開發(fā)微生物資源的關(guān)鍵是獲得所需要的菌種，優(yōu)良的微生物菌種是工業(yè)微生物技術(shù)的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)一 紫外線誘變育種 —— 繪制細(xì)胞存活 率和突變率曲線 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵? 進(jìn)一步理解誘變劑對(duì)微生物的殺菌和誘變雙重生物學(xué)效應(yīng)； 學(xué)習(xí)紫外線誘變的方法及測(cè)定誘變劑最適劑量的方法。但照射繼續(xù)增加到一定程度時(shí)，其殺菌率也隨之增大，而突變率卻降低。以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞存活率或死亡率和突變率為縱坐標(biāo)作圖，突變率最高值相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞死亡率即為最適劑量。 四、實(shí)驗(yàn)方法 菌體 培養(yǎng) 取斜面菌種一環(huán)，接種于盛有 20ml肉湯培養(yǎng)基的 250ml 三角瓶中， 37℃ 振蕩培養(yǎng) 6－ 18h，取 1ml 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于另一盛有 20ml 肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中， 37℃ 振蕩培養(yǎng) 6－ 8h，使細(xì)胞培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)增殖期狀態(tài)。 活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞懸浮液濃度 取 1ml細(xì)胞懸浮液，逐步稀釋為 10－ 10－ 10－ 3??。稀釋倍數(shù) 誘變處理 （ 1）取 10ml 菌液于直徑 90mm 培養(yǎng)皿中（帶有磁棒），將皿放置于誘變箱的磁力攪拌器上。 （ 4）?。?3）中同樣的稀釋菌液毫升，置于平皿中，傾入融化并冷卻至 45－ 50℃的細(xì)菌基本培養(yǎng)基 15ml，充分混勻，凝固后置 37℃ 培養(yǎng) 1－ 2 天，計(jì)數(shù)每平皿菌落數(shù)（每個(gè)稀釋度作三個(gè)平行）。 繪制細(xì)胞存活率和突變率曲線 表 1 紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌存活率的影響 照射時(shí)間 稀 釋度 平板菌落數(shù) （個(gè) /毫升） 細(xì)胞濃度平均值（個(gè) / 毫升） 存活率(%) 1 2 3 15s ① ② ③ 30s ① ② ③ 45s ?? 90s 對(duì)照（處理前） ① ② ③ 表 2 細(xì)胞回復(fù)突變率 照射時(shí)間 稀釋度 平板菌落數(shù) （個(gè) /毫升） 回復(fù)突變細(xì)胞濃度（個(gè) /毫升） 回復(fù)突變率(%) 1 2 3 15s ① ② ③ 30s ① ② ③ 45s ?? 90s 對(duì)照（處理前） ① ② ③ 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 繪制細(xì)胞存活率和突變率曲線。從菌落形態(tài)和產(chǎn)酶特性等證實(shí)此融合子是兩親株融合所得的雜 交子代。 （ 4）高滲半固體肉湯培養(yǎng)基 于肉湯培養(yǎng)基中，加入 ,瓊脂 ％。 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 原生質(zhì)體制備 （ 1）菌體培養(yǎng) 將兩親本 D811 和 B928 菌株活化的斜面菌株 1 環(huán)，分別接種于裝有 20ml制備原生質(zhì)體用液體培養(yǎng)基的 250ml 三 角瓶中， 35℃ 振蕩培養(yǎng) 14h（ B928 菌株在培養(yǎng)結(jié)束前 2h，向培養(yǎng)液中加入終濃度為 1 單位 /毫升的青霉素鉀，繼續(xù)培養(yǎng)2h）。 （ 2）原生質(zhì)體制備 取兩親本菌懸液各 3ml，分別加入終濃度為 3 毫克 /毫升的用 SSM 溶液配制的過(guò)濾除菌的溶菌酶液， 34℃ 振蕩處理 30min，隨時(shí)鏡檢，當(dāng) 95％以上細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體，即終止酶的作用。 取 1ml 原生質(zhì)體，以 SSM 溶液作適當(dāng)稀釋，取 稀釋液與 4ml 高滲半固體肉湯培養(yǎng)基混合，迅速傾入底層為高滲固體肉湯培養(yǎng)基平板上， 35℃ 培養(yǎng) 2天，測(cè)定原生質(zhì)體再生率。 融合子的篩選