細(xì)胞凋亡實驗技術(shù)總結(jié)(已修改)
2025-10-24 06:32 本頁面
【正文】 第一篇：細(xì)胞凋亡實驗技術(shù)總結(jié)細(xì)胞凋亡實驗技術(shù)總結(jié) 一形態(tài)學(xué)檢測光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡觀察法未染色細(xì)胞:凋亡細(xì)胞體積變小、變形，膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，變圓，脫落。染色細(xì)胞:姬姆薩染色，瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀，形成凋亡小體。熒光顯微鏡檢測法熒光染料例如，碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。選用536nm 激發(fā)光，細(xì)胞核呈紅色熒光。電子顯微鏡收集細(xì)胞，%戊二醛4176。C 固定24h，1%四氧化鋨后固定，丙酮梯度脫水，經(jīng)包埋劑浸透后環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。Ⅱa 期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化。細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)FITCAnnexinV+PI雙染，觀察凋亡過程中細(xì)胞膜PS表面的變化，并區(qū)分正常細(xì)胞(AnPI)，早期凋亡細(xì)胞(An+PI)，晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞(An+PI+)，細(xì)胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞(AnPI+)。二、細(xì)胞凋亡的生化及分子生物學(xué)檢測DNA 斷裂檢測法如使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，細(xì)胞凋亡時，核染色質(zhì)凝聚，染色質(zhì)DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂。凋亡早期可形成50~300kbp 的DNA 大片段，晚期核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180~200bp 整數(shù)倍的寡核苷酸片段。膜聯(lián)蛋白V 法磷脂酰絲氨酸(PS)位于正常細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS 可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面。AnnexinⅤ(膜聯(lián)蛋白V)是一種分子量為3536KD 的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS高親和力。將AnnexinⅤ進(jìn)行熒光素或生物素標(biāo)記，以標(biāo)記了的AnnexinⅤ作為探針，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡的酶Caspase檢測檢測Caspase活力可用免疫雜交技術(shù)分析酶原的加工和底物水解的產(chǎn)物，或用人工底物檢測酶活力，也可對活化的Caspase做親和標(biāo)記。例如分析底物的水解產(chǎn)物，PARP(多聚ADP核糖聚合酶)第一個被認(rèn)識的caspase3底物，它的相對分子質(zhì)量為116000，水解后形成相對分子質(zhì)量為85000 及相對分子質(zhì)量為25000 的兩個片段，用抗相對分子質(zhì)量為85000 片段的抗體檢測細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。線粒體膜勢能變化的檢測線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱反映了線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度或熒光顯微鏡觀察，拍照正常細(xì)胞中, Rh123 能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)度減弱或消失。而凋亡時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，引起線粒體跨膜電位的崩潰, Rh123 重新釋放出線粒體, 從而發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光。第二篇：細(xì)胞凋亡總結(jié)細(xì)胞凋亡 凋亡（apoptosis）一般是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下，通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death)。一般表現(xiàn)為單個細(xì)胞的死亡，且不伴有炎癥反應(yīng)。1．細(xì)胞凋亡的意義 細(xì)胞凋亡普遍存在于生物界，既發(fā)生于生理狀態(tài)下，也發(fā)生于病理狀態(tài)下。由于細(xì)胞凋亡對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時引起的細(xì)胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義，至今仍是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點。細(xì)胞凋亡過多可引起疾病發(fā)生，如：①愛滋病的發(fā)展過程中，CD4+T細(xì)胞數(shù)目的減少；②移植排斥反應(yīng)中，細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞死亡；③缺血及再灌注損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡增多；④神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾?。ˋlzheimer病、Parkinson39。s?。┑闹匾蚴羌?xì)胞凋亡的異常增加。神經(jīng)細(xì)胞的凋亡參與老化及Alzheimer病的發(fā)生。Alzheimer氏病是一種常見的老年病，患者在臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性的智力減退。⑤暴露于電離輻射可引起多種組織細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡過少也可引起疾病發(fā)生：在腫瘤的發(fā)生過程中，誘導(dǎo)凋亡的基因如p53等失活、突變，而抑制凋亡的基因如bCL2等過度表達(dá)，都會引起細(xì)胞凋亡顯著減少，在腫瘤發(fā)病學(xué)中具有重要意義；針對自身抗原的淋巴細(xì)胞的凋亡障礙可導(dǎo)致自身免疫性疾?。荒承┎《灸芤种破涓腥炯?xì)胞的凋亡而使病毒存活。2．細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化 電鏡下細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化是多階段的，可分為 ①細(xì)胞漿濃縮，核糖體、線粒體等聚集，細(xì)胞體積縮小，結(jié)構(gòu)更加緊密； ②染色質(zhì)逐漸凝聚成新月狀附于核膜周邊，嗜堿性增強(qiáng)。細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，進(jìn)而斷裂為大小不一的片段：③胞膜不斷出芽、脫落，細(xì)胞變成數(shù)個大小不等的由胞膜包裹的凋亡小體(apoptotic bodies)。凋亡小體內(nèi)可含細(xì)胞漿、細(xì)胞器和核碎片，有的不含核碎片；④凋亡小體被具有吞噬功能的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等吞噬、降解： ⑤凋亡發(fā)生過程中，細(xì)胞膜保持完整，細(xì)胞內(nèi)容物不釋放出來，所以不引起炎癥反應(yīng)。左圖 典型凋亡小體：染色質(zhì)呈新月狀，并可見細(xì)胞器 右圖 凋亡細(xì)胞：凋亡細(xì)胞(↑)與鄰近細(xì)胞分離 細(xì)胞凋亡 光鏡下凋亡一般累及單個或少數(shù)幾個細(xì)胞，凋亡細(xì)胞呈圓形，胞漿紅染，細(xì)胞核染色質(zhì)聚集成團(tuán)塊狀。由于凋亡細(xì)胞迅速被吞噬，又無炎癥反應(yīng)，因此，在常規(guī)切片檢查時，一般不易發(fā)現(xiàn)，但在某些組織如反應(yīng)性增生的次級淋巴濾泡生發(fā)中心則易見到。病毒性肝炎時，嗜酸性小體形成即是細(xì)胞凋亡。3．細(xì)胞凋亡的機(jī)制 細(xì)胞凋亡是一系列依賴能量的分子水平變化的終點，細(xì)胞凋亡過程包括以下4個階段，即：誘導(dǎo)啟動、細(xì)胞內(nèi)調(diào)控、實施和凋亡細(xì)胞的吞噬搬運(yùn)階段。（1）誘導(dǎo)啟動 引起凋亡的信號可以來自細(xì)胞外，通過跨膜傳導(dǎo)對細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控分子起作用；也可以直接作用于細(xì)胞內(nèi)的靶分子。一些跨膜作
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