dna序列測(cè)定ppt課件(已修改)
2025-05-17 12:09 本頁(yè)面
【正文】 第九章 DNA序列測(cè)定 第一節(jié) 概 述 一、 DNA序列測(cè)定 即 核酸 DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項(xiàng)重要的技術(shù) 。 1963年， Sanger和 Thompson等人第一次完成胰島素 51個(gè)氨基酸的序列測(cè)定，這在當(dāng)時(shí)來(lái)說(shuō)是一件了不起的大事。 70年代后期， Sanger和 MaxamGilbert等人又建立了核酸序列測(cè)定的方法， Sanger雙脫氧末端終止法和 MaxamGilbert化學(xué)裂解法將核酸序列測(cè)定技術(shù)推進(jìn)到“直讀”階段，使核酸序列測(cè)定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測(cè)定容易，這樣人們可以通過(guò)核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。 二、 DNA序列測(cè)定工作原理 在四種反應(yīng)體系中，寡聚核苷酸分別終止于不同位置的 A、 T、 G或 C堿基，將待測(cè) DNA片段轉(zhuǎn)變成一系列放射性核素標(biāo)記的單鏈 DNA片斷，并使其一端為一固定的末端，而另一端由于長(zhǎng)度不同，成為一系列相差 1個(gè)堿基的連續(xù)末端。經(jīng)電泳分離，放射自顯影，可直接讀出DNA的序列。 三、核酸序列分析的目的意義和策略 （具體方法） （一）序列分析的目的， 2種： 確證性測(cè)序 通過(guò)測(cè)定對(duì)突變進(jìn)行定位和鑒定，應(yīng)用時(shí)測(cè)定野生型基因上同源區(qū)和突變體的相應(yīng)序列直接在一張膠片上比較二者序列差異。（已知基因序列） 從頭序列 目的是提供一段 DNA準(zhǔn)確的核苷酸序列。（未知基因序列） （二）測(cè)定在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相應(yīng)應(yīng)用， 2個(gè)方面： 對(duì)已知基因序列檢查，特別是有遺傳傾向的病例檢測(cè)相關(guān)基因有無(wú)突變，有助于闡明疾病發(fā)病機(jī)理及建立相應(yīng)診療方案。 對(duì)已經(jīng)克隆的未知序列進(jìn)行測(cè)定，從而闡明該基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)，如人類基因組計(jì)劃中大量的工作是要闡明克隆片段的核苷酸的排列順序。 （三）序列分析的策略（具體方案） 測(cè)序目的不同或靶 DNA片段大小有區(qū)別，則序列分析的具體方案有所不同，所以測(cè)序之前應(yīng)根據(jù)相應(yīng)情況制訂序列測(cè)定的策略，這個(gè)問(wèn)題在后面將涉及到，但由于學(xué)時(shí)限制，不可能完全展開來(lái)講，請(qǐng)同學(xué)參看相關(guān)書籍。 四、測(cè)序的常用方法 DNA序列測(cè)定常用方法有如下 3種： 末端終止法 化學(xué)裂解法 DNA測(cè)序自動(dòng)化 使用特異性引物與單鏈模板 DNA退火，在 DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用 ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長(zhǎng)度僅相差 1個(gè)核苷酸的ssDNA，從而完成測(cè)序的方法。 用化學(xué)試劑在 A、 G、C、 T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長(zhǎng)度的短鏈，經(jīng)過(guò) PAGE放射自顯影可直讀 DNA順序。 類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。 優(yōu)點(diǎn) 簡(jiǎn)便、迅速、應(yīng)用廣泛。 不需酶促反應(yīng)，可以對(duì)寡核苷酸測(cè)序。 高負(fù)荷， 1塊膠可測(cè)16個(gè)樣品； 機(jī)讀不需放射自顯影； 安全不用同位素； 簡(jiǎn)單迅速 810h。 不管是上述哪一種方法，測(cè)序基本過(guò)程如下： 制備待測(cè) DNA序列模板； 酶促或化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)變“等差數(shù)列”（ n=1）； PAGE； 讀序。 （ P255,圖 102） 五、測(cè)序的基本過(guò)程 六、測(cè)序技術(shù)的最近發(fā)展 商品化測(cè)序試劑盒 解決了質(zhì)粒問(wèn)題，節(jié)省了時(shí)間，但缺乏靈活性。 自動(dòng)化測(cè)序儀 以酶學(xué)測(cè)序反應(yīng)或（和）放標(biāo)測(cè)序產(chǎn)物為基礎(chǔ)，微機(jī)處理。 熱循環(huán)測(cè)序 使極少數(shù)測(cè)序產(chǎn)物線性放大。 測(cè)序商品化 .￥，搞定。 七、 DNA序列測(cè)定的應(yīng)用 分析基因組核苷酸排列序列 分析基因序列 基因定點(diǎn)誘變的基礎(chǔ) 基因工程載體構(gòu)建中 DNA序列定位和排序的基礎(chǔ) 確定 DNA序列中蛋白質(zhì)的編碼區(qū) 第二節(jié) Sanger雙脫氧末端終止法 一、原 理 （一） DNA復(fù)制的 4個(gè)基本條件 ssDNA模板 DDDP 帶有 3’OH末端的單鏈寡核苷酸引物 4種 dNTP （二）鏈終止劑（ chainreminator） 2， 3二脫氧核糖核酸酶
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1