【正文】 從純化到星辰CSH蛋白質(zhì)純化課側(cè)記Royluo 引子 　 2000年5月6日，我一個人在合肥三孝口書店閑誑,希望買點參考書帶出國去。我注意到有一本翻譯過來的書，書名叫做《蛋白質(zhì)純化與鑒定實驗指南》。這本書很奇怪，里面列出了很多具體實驗的步驟和解釋。我很快意識到，這本書實際上是冷泉港實驗室開設的一門《蛋白質(zhì)純化與鑒定》實驗課的教材。這本書深深的吸引了我，因為里面記錄的實驗十分經(jīng)典，涵蓋了蛋白質(zhì)純化中可能用到的大部分手段，并且對實驗細節(jié)有十分詳盡的解釋。我對這本書愛不釋手，于是就買了下來,而且當時就動了上這門課的念頭。這是一個很模糊的想法，沒有想到的是，五年以后這個想法竟然實現(xiàn)了。 這一系列文章是我對這次上課經(jīng)歷的全面總結，一部分是八卦，一部分是流水賬般的記敘，還有一些是從這課程學到的tricks,最后也摻雜著自己過去做蛋白質(zhì)純化的心得。想到哪說到哪，文字挺松散的，見笑了。 我來解釋一下標題。課程結束之后，每一個學員都有一份證書，印著PerPuraAdAstra幾個大字。這是拉丁語，直譯就是“從純化到星辰”。原始的諺語是,PerAsperaAdAstra,意思是throughsufferingtorenown。所以“從純化到星辰”實際的意思是，做好蛋白質(zhì)純化，以后就容易出人頭地。呵呵。（二）同學和老師 　冷泉港的《蛋白質(zhì)純化與鑒定》培訓班歷史相當悠久，從1989年開始每年都開課，到今年是第十六次。每年都是四月初開始，持續(xù)兩個星期。值得一提的是，冷泉港有相當多的培訓班和會議，是一個科學家交流和學習的中心。這是冷泉港享有盛名的最主要原因。 　2004年底,我下定決心上這門課，于是遞交了申請。二月份的時候的到消息，我被錄取了，并且還有1000刀的tuitionwaiver。可我還是高興不起來，因為還得解決1600刀(學費一共2600刀)。老板人很nice,但是他實在沒錢了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解決了，去年的退稅就這樣全搭進去了,欲哭無淚啊。 　四月五號下午我趕到冷泉港，辦完登記手續(xù)后被告知晚上七點全體開會，與教員和同學見面。老師一共有四個，每人負責一個模塊的實驗，持續(xù)三天時間,每個老師都有一兩個助手幫忙。學生則一共有16個，分成四組，輪轉(zhuǎn)式的做完四個模塊。我這一組其他三個人是:來自coloradoBoulder的chad,做有絲分裂的。來自Princeton的Adam,做海洋生物學的。Chad和Adam都是博士后。第三個是來自丹麥的Charlotte，是個博士生，做植物的。 現(xiàn)在開始八卦一下幾個老師，^_^ 總負責人是來自wisconsinmadison的RichardBurgess教授,這老頭很有意思，帶這個培訓班已經(jīng)帶了十二年了，到現(xiàn)在還是樂此不疲。他六十年代是watson的博士后，watson似乎跟他關系很好，每年純化課的時候，watson都會跑到培訓班的實驗室找Burgess聊天，同時拉他去吃飯什么的。后來的有一天，我還真的看到了watson去找他聊天。不過令人驚訝的是，watson此人相當精神，走路象年輕人。watson此人口碑很不好，很自大。連Burgess教授一次和我們吃飯的時候都承認，watson有時候口無遮攔，讓他都覺得很難堪。但是Burgess又承認watson對他自己的學生很支持，很提拔，這幾年又盡心盡力為冷泉港籌 款，貢獻巨大。 　第二位教員是來自UCLA的AlbertCourey教授。這位教授人很nice也很幽默，四位老師中我對他印象 最好。申請這個課前，我先跟他發(fā)過詢問這個課的情況，而他也鼓勵我申請。這老哥研究果蠅的,但是他卻負責教一組純化轉(zhuǎn)錄因子的實驗。我一開始不太理解，后來問他的學術經(jīng)歷，才明白是怎么回事。原來這老哥博士是做生化，博后跟的是robertTjian（錢澤南），還是做生化，研究轉(zhuǎn)錄因子。后來做了faculty之后，決定用果蠅做模型來研究轉(zhuǎn)錄因子。他那時侯不懂果蠅的遺傳學，完全靠自學和到處問人。我知道后覺得特佩服，真正的科學家不應該被自己過去所受的訓練束縛死了，應該是根據(jù)研究的需要隨時準備學習新東西。這老哥雖然不是最年輕的，但是卻很能跟上年輕人的潮流，比如他說他有一個ipodmini,還在網(wǎng)上itunes商店買過歌。我還跟他就ipod聊了一陣子，因為我也有個ipod。 第三位教員是來自TexasMDandersoncancercenter的suehwalin教授。她是一個身材瘦小的中年婦女，臺灣人，特搞笑，非常喜歡給我們講她博士后老板的笑話。一個笑話是這樣的,有一天有一個學生向這個老兄投訴說和實驗室另一人有矛盾。這個老兄想了想，然后一本正經(jīng)的說，和人產(chǎn)生矛盾了，一般有三種選擇。第一種呢，就是既然你恨他，那就殺了他好了。那個學生聽了之后，差點倒了。這個老兄說看起來你丫沒這膽量，那還有第二種選擇，就是殺了你自己。那個學生聽了幾乎要吐血。這老兄一看樂了，然后說你既然沒種殺人或者自殺，就剩第三種選擇了,就是ignorethatguy!!!哈。還有另一個笑話，suehwalin的 博士后老板雖然當了老板，但是還是喜歡做實驗，并且和一個博后共用一個bench。有一天那個博后指著這老兄的鼻子說，XXX呀，你把bench弄得太亂了，趕快給我清理干凈了。這老兄聽了之后也不怒，而是慢條斯理的辯解說，每個人都有自己喜歡的工作方式，我喜歡亂，你丫管我呢，要是不喜歡，我們可以在bench上畫條線劃清界線，從此井水不犯河水。哈哈哈。這老美連三八線都出來了。 第四位教授是rutgersuniversity的konstantinSeverinov副教授，這老兄是俄羅斯人，這四位老師中最年輕的一位。此君滿頭亂發(fā)，一臉大胡子，看起來很邋遢，所以一開始我對他印象不佳。后來發(fā)現(xiàn)此人相當nice。Konstantin特搞，有一次他做報告，他的電腦的桌面上有一堆亂七八糟的文件夾，其中有一個竟然是divorce!我告訴坐我旁邊的一個老美，老美說也注意到了，認為實在是很sad，呵呵。另外，他有兩個未成年的兒子，喜歡不斷打他手機。結果他常常講實驗講到一半就得停下來接電話。這個課結束之后，他還跑到冷泉港書店買了一堆蟲子毛絨玩具給兩個兒子做紀念品。舔犢情深，可見一斑。（三）不溶的sigma32 　　四月六號早上，我們開始了第一模塊的實驗，Burgess教授負責。　polymerase。RNApolymerase 核心酶是一個蛋白質(zhì)復合體，只有合成RNA的活性，卻沒有識別DNA的能力。Sigma系列因子能夠識別啟動子,并且與核心酶結合，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄。我們這個實驗 的核心主角就是其中一個因子，叫sigma32。Sigma32可以識別heatshockgenes的啟動子。Sigma32過表達在大腸桿菌里面的時候，絕大部分形成了不溶的包涵體(inclusionbody),我們的任務就是要用變性 劑溶解變性不溶的蛋白，然后做重折疊。 所有的buffer幾乎都已經(jīng)配好了，所以直接做就行了。我們先用1%Triton來溶解細菌本身的一些蛋白，inclusionbody相當穩(wěn)定，不溶于triton,所以這一步，絕大部分垃圾就被去掉了。 下一步就是用變性劑來溶解inclusionbody。用什么好呢？Burgess教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N十二烷基肌氨酸鈉）是一種比較強的陰離子去垢劑,%的濃度就可以讓包涵體溶解。sarkosyl的優(yōu)點是，雖然在高濃度下有變性作用，低濃度下卻對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定的作用。所以用sarkosyl做重折疊之前的變性劑是再好也不過的了。 　Burgess還要我們試了經(jīng)典的GudnHCl（鹽酸胍)來變性，作為對比。inclusionbody在這兩種變性劑下很容易就溶解了。然后我們得去掉變性劑，做重折疊。怎么做呢？方法有很多種，最簡單的是透析，把變性劑全部換掉。這個方法Burgess并不喜歡，因為，透析是個緩慢的過程。在透析袋里面，蛋白的濃度還是很高。折疊中間產(chǎn)物容易相互接觸形成不溶的聚合物。另一種方法是突然稀釋變性的蛋白，由于蛋白濃度相對與透析低了很多，好一點。但是問題也是類似的。Burgess提議用逐步滴加稀釋的辦法。就是放一大燒杯的緩沖液，里面有一個磁石可以不斷混合液體，然后一滴一滴加入變性的蛋白溶液。由于燒杯里的溶液蛋白量是逐漸增加的，所以一開始蛋白折疊中間產(chǎn)物能夠相互作用的幾率大大降低了。Burgess說的還真象那么回事，可事實上，嘿嘿。我們先用試著重折疊GudnHCl溶解的Sigma32。一開始還好，滴到后來，溶液就變渾濁了，最后幾乎成了沖淡了的牛奶那樣的東東。Burgess臉色不好看，說不應該這樣的。我們一離心，沉淀出來一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清跑了一個PorosHQ50陰離子交換柱，拿到的蛋白很少，回收率小于5%。失敗啊。 　從這里開始，我要岔開一下，講一些跟這個模塊實驗沒太大關系，但是很有意思的東西。（四）Hydrostaticpressure和跑小柱子的trick 　　Dr.Burgess假定我們對蛋白質(zhì)純化一無所知，所以講得很細致。比如他特別提到了disposablecolumn的用法。這種小柱子很簡單，把beads倒進去，沖洗一下就可以用來純化蛋白了，很方便。唯一的問題是，由于是依靠重力跑，速度有時候會十分慢。液體流經(jīng)柱子速度由hydrostaticpressure(靜流體壓力）來決定。而hydrostaticpressure又是由實際柱高(即液體經(jīng)過的長度)來決定。如果你嫌液體流得太慢（尤其是洗柱子的時候），可以在柱子下端出口連一個長的塑膠管子或者針管，這樣速 度會快很多。這是很簡單的小trick,但我覺得對初做蛋白質(zhì)純化的人還是很有幫助的。 　　我知道一個例子。我原來很喜歡女生A,有一天晚上主動等在她實驗室等她做完實驗，就開車送她回家。這一等不得了，從晚上七點等到了凌晨一點。這個過程中，她好像沒什么事情，但是每隔20分鐘，她就會去一次coldroom。作完實驗了之后，我好奇的問她，到底是什么試驗花了這么長時間，結果她說她在用一個disposablecolumn純化蛋白，由于beads稍微多了一點，速度很慢，而protocol有一步要求用數(shù)百毫升的洗液來沖洗柱子。所以她每隔二十分鐘就去加洗液，所以白白花了好幾個小時。我聽了之后都要ft了,沒想到她們實驗室竟然沒有人告訴她,有簡單的辦法可以讓柱子跑得快一點的。只要在下端出口加一個長管子，她至少可以少等兩個小時。　 當然最簡單的辦法還不是這個，最簡單的辦法的是把盛有洗液的容器放高，然后利用虹吸的原理讓液體源源不斷的流經(jīng)柱子。同時，柱子的下端連上塑膠管，彎成一個連通器，這個連通器的高度應該略高于柱面，這樣沖洗結束后，柱子就不會干。如果用這種方法，A就不用在實驗室待一晚上了，因為一切都是自動完成的。 　我現(xiàn)在跟A已經(jīng)完全沒有來往了,但我對她映象還是十分深刻，主要就是因為她那晚跑柱子的經(jīng)歷。話撤遠了，現(xiàn)在再回到蛋百質(zhì)純化課。（五）萬金油buffer 　Dr.Burgess這人特有意思，喜歡吹噓他發(fā)現(xiàn)的小trick。比如，他得意說他是全美國最早用coomassieblue染蛋白膠的人。據(jù)他說，六幾年的時候他看到一個澳洲的老兄的一片文章,講述一種新奇的染料叫考馬市亮藍,比當時流行的染料amidoblack靈敏十倍以上。所以他就寫了一封信要了一些，結果效果奇好。我們聽得都目瞪口呆。 　不過Burgess最自豪的，還是他的“萬金油”buffer。他告訴我們說，他幾十年了，總喜歡用這個buffer的配方，什么蛋白都喜歡這種buffer,可以說到了包治百病的神奇地步。盡管他吹得神乎其神，配方卻十分簡單。這個buffer叫TGE,就是Tris,glycerol和EDTA。配方是這樣的: 50mMTrispH EDTA 50mMNaCl 5%glycerol　　 TrisEDTANaCl這三樣都沒什么，真正關鍵的是5%glycerol。有了這個glycerol,很多蛋白，尤其是酶會十分穩(wěn)定。這個穩(wěn)定的效果是十分驚人的。六十年代的時候，他還是個小博士后，在watson實驗室里干，主要是純化細菌RNApolymerase的各個亞基。那時候一個大問題是RNApolymerase純化出來后十分不穩(wěn)定,放冰上,過30分鐘，活性還會損失一半。Burgess有一次不小心出了錯誤，把純化出來的RNApolymerase和glycerol混合了。結果意外發(fā)現(xiàn)，RNApolymerase變得十分十分的穩(wěn)定。穩(wěn)定到什么程度呢,就是你把這個酶加上50%glycerol，用平信從美國寄十幾天到澳洲，活性還有7~80%！另外Burgess也提到，如果要保存的蛋白有二硫鍵，加一點DTT，防止蛋白形成非天然的二硫鍵,也會對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有好處。 　為了讓我們對這個萬金油buffer的好處有感性認識,Burgess設計了一個實驗讓我們做。他之前已經(jīng)準備好了在大腸桿菌中表達的GFP包涵體(inclusionbody)。我們把包涵體分成兩部分，一部分用guanidiniumhydrochloride（鹽酸胍）溶解變性，另一部分用sarkosyl(N十二烷基肌氨酸鈉）溶解變性。然后把這些溶解的GFP溶液分到一個96孔板上,每個孔10微升，然后加入２０倍的refoldingbuffer來稀釋，稀釋了之后，變性的GFP就開始重折疊。我們有一個hampton賣的refolding試劑盒，內(nèi)有十幾種不同配方的refoldingsolution。我們試了所有這些buffer同時還試了TGE,TGE+15%glycerol,TGE+35%glycerol,TGE+45%glycerol,這四種buffer。由于GFP折疊好了才能發(fā)