【正文】 可因結(jié)構(gòu)散亂而失去固有的聯(lián)系，形成移位。 明膠冰凍切片可避免以上情況的發(fā)生。 步驟： 參考教科書 P21 三、冰凍切片粘片法 1. 蛋白甘油粘片法 2. Lillie明膠粘片法 3. 酒精明膠粘片法 四、冰凍切片注意事項(xiàng) 1. 所有試劑和機(jī)器都要處于可供使用的狀態(tài) 2. 切去的組織塊大小適宜，厚度小于 2mm，并盡快臵于冰凍切片機(jī)上制備切片 3. 調(diào)節(jié)冰凍程度，試切合適時(shí)便迅速切片，冰凍不足無法切片，冰凍過度切片易碎 4. 固定：切片后應(yīng)立即投入甲醇中固定，否則會(huì)造成細(xì)胞的退變，固定液有很多種（乙醚＋酒精，酒精＋冰醋酸，甲醇，乙醇，丙酮），但是經(jīng)過實(shí)踐認(rèn)為，甲醇作用快，受縮小，染色較清晰，是最理想的固定劑，如加 5%冰醋酸，效果更好。 5. 包埋劑：可用普通膠水代替，最好加入適量 的水（膠水：水＝ 2： 1） 6. 做冰凍切片應(yīng)帶手套，防止感染，注意不要切到手！ 7. 切片一般在 5um. ，不要有皺褶，染色要清晰，防止有冰晶（托盤要放入機(jī)箱待用， OCT盡量少一些，要用冷錘） 補(bǔ)充要點(diǎn)：關(guān)于切片質(zhì)量 冰晶多：這是最普遍的現(xiàn)象，主要原因是冷凍速度慢：（ 1）將標(biāo)本托盤放在外面，這是錯(cuò)誤的，熱的托盤會(huì)延長(zhǎng)冷凍的時(shí)間，增加冰晶的產(chǎn)生。（ 2）膠放得太多，同樣也會(huì)延長(zhǎng)冷凍的時(shí)間。 冰晶會(huì)使診斷產(chǎn)生誤診，特別是軟組織腫瘤和含水量較高的組織。 細(xì)胞退變：切片粘在玻片上要立即固定，固定時(shí)間越快，細(xì)胞退變?cè)缴?，從固定速度上看，甲醇是最快也是最好的? 細(xì)胞收縮： 用電吹風(fēng)吹或用丙酮固定，都會(huì)引起細(xì)胞收縮，但如果沒有對(duì)照，不是很明顯。 染色較淺： 主要是蘇木素的染色時(shí)間 應(yīng)該用顯微鏡觀察一下 切片有很多空洞： 主要是肝臟，由于動(dòng)物冷凍后發(fā)脆，粗切時(shí)肝組織呈大塊大塊的粉狀，肝切片上有很多的小白點(diǎn)（即肝組織掉出），這就要求我們多細(xì)切幾下。 皺折： 主要是選擇展片的方法不一樣造成：有的 用毛筆慢慢拉下在切片臺(tái)上，然后用玻片粘；有的用毛筆在組織塊成小卷后拉開，然后用玻片粘；這二種情況在組織好切，心情平各時(shí)，也能做出好片子。但在比賽時(shí)，腎上腺素較高，手多多少少會(huì)顫抖，容易造成拉力不均勻，導(dǎo)致切片出現(xiàn)小皺。還有組織邊上留膠太少，會(huì)造成組織邊緣出現(xiàn)皺折。 組織發(fā)脆： 冰凍切片機(jī)冷凍室的溫度冬天一般設(shè)在－19℃ ，夏天設(shè)在－ 22 ℃ 不同的組織，對(duì)溫度要求不一樣，肝臟和甲狀腺－ 15 ℃ ，脂肪組織－ 35 ℃ 如果遇到組織有很多的裂痕 ，說明溫度過低，可用手指稍微去摸一下 冰脆： 核退變： 冰晶多 冰晶少 大組織石蠟切片法 制備大組織塊可觀察完整的組織病變情況，以及保持結(jié)構(gòu)上的連續(xù)性。有時(shí)在病理診斷上有重要的意義。 因?yàn)橛行┎∽冊(cè)谌庋凵蠠o法分辨正常組織和病變組織的界限，尤其像甲狀腺組織腫瘤，觀察有無胞膜浸潤(rùn)或胞膜是否完整，如不用大塊組織，則必須將一完整腫瘤的斷面分成若干小組織塊，如果包埋不當(dāng)或者切面不正，則無法全面觀察病變組織的分布情況 而影響診斷。 因此制備大組織石蠟切片很有必要。 制備方法： 1. 固定后取材 2. 沖洗 3. 脫水，透明，浸蠟 表格參考 P17 4. 包埋 5. 切片：大塊組織切片較難，可采用以下方法較少阻力 （ 1）包埋可采用 52－ 54℃ 的石蠟，以減少一些硬度。 （ 2）切片前蠟塊不需要冰箱內(nèi)冷卻，防止過硬 （ 3）切片刀要鋒利，組織蠟塊稍傾斜，以較少阻力。 6. 展片和烘片 其它切片法 1. 塑料切片法 塑料包埋組織的切片方法與常規(guī)切片方法相同。可同時(shí)進(jìn)行光鏡和電鏡的檢測(cè)，定位準(zhǔn)確。塑料包埋切片的厚度可達(dá) －2um（半薄切片）。 塑料切片主要用于免疫電鏡的超薄切片前定位。包埋前染色的標(biāo)本，切半薄切片后不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察。免疫反應(yīng)部位成黑點(diǎn)狀，定位后進(jìn)一步做超薄切片，這樣可明顯提高免疫電鏡陽(yáng)性檢出率 。 2. 碳蠟（ PEG）切片 按石蠟切片法切片，但在操作中注意碳蠟塊盡量不要接觸水和冰塊，儲(chǔ)存應(yīng)密封干燥冷藏 該方法的缺點(diǎn)是夏季室溫高時(shí)，切片困難，連續(xù)切片不如石蠟切片容易，碳蠟吸水性較強(qiáng)，也不易長(zhǎng)期保存。 3. 超薄切片 用于電鏡標(biāo)本的制備 4. 石蠟包埋半薄切片法 同常規(guī)方法，但切片刀要鋒利，最好用一次性刀片，氣溫高時(shí)，可將蠟塊和切片刀冷卻后切片。 HE染色 蘇木精 — 伊紅染色法 ( hematoxylineosin staining ) ，簡(jiǎn)稱 HE染色法 ，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。蘇木精染液為堿性 ，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色 ；伊紅為酸性染料 ，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色 。 HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。 試劑配置 ? A： ~1% 的伊紅酒精溶液： ? 稱取伊紅 Y ~1 g，加少量蒸餾水溶解后，再滴加冰醋酸直至漿糊狀。以濾紙過濾，將濾渣在烘箱中烤干后，以 95%酒精（即工業(yè)酒精，如果不怕浪費(fèi)，用無水乙醇配制也可） 100毫升溶解。 ? B：蘇木素染液配方： ? 蘇木精 2g ? 無水乙醇 250 ml ? 硫酸鋁鉀 g ? 蒸餾水 750 ml ? 碘酸鈉 g ? 冰醋酸 20 ml 配制方法：將蘇木素溶于無水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水 .兩溶液溶解后將其混合，加入碘酸鈉，最后加入冰醋酸。 C： 1%鹽酸酒精分化液：將 1毫升濃鹽酸加入99毫升 70%酒精中即可。 分化： 用某些試劑，將過度染色或者不需要著色的組織成分上的顏色除去。 藍(lán)化： 用明礬蘇木素液深染細(xì)胞核后，通過鹽酸乙醇的分化，切片從酸性環(huán)境中（此時(shí)，切片呈紅褐色）轉(zhuǎn)移至流水中使之變藍(lán)的過程。明礬蘇木素液這種紅變藍(lán)的現(xiàn)象，本質(zhì)上是染料蘇木紅加鋁（藍(lán)色色精）之間的結(jié)合或者中斷關(guān)系。一般來講，在酸性環(huán)境中，使深藍(lán)色的色精處于離子狀態(tài)，此時(shí)為紅色，這種現(xiàn)象稱色精形成中斷。相反，紅色離子狀態(tài)的色精，在堿性環(huán)境中（相對(duì)地說）處于結(jié)合狀態(tài)，這種現(xiàn)象稱色精形成，并呈藍(lán)色。 ? 染色流程 ? (1)二甲苯（ Ⅰ ） 10min ? (2) 二甲苯（ Ⅱ ） 10 min ? (3)100%乙醇（ Ⅰ ） 1min ? (4)100%乙醇（ Ⅱ ） 1min ? (5)80%乙醇 2min ? (6)蒸餾水 12min ? (7)蘇木精液染色 5 min ? (8 ) 流水稍洗去蘇木精液 13 s ? (9) 1%鹽酸乙醇 13 s (11)流水沖洗 10min ? (12) %伊紅液染色 13 min ? (13) 蒸餾水稍洗 12 s ? (14) 80%乙醇稍洗