【正文】 胞 神經(jīng)細(xì)胞 大鼠 海馬神經(jīng)細(xì)胞 2 非貼附型細(xì)胞 ? 懸浮型細(xì)胞：指細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。 ? 見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。 ? 這種細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)：胞體始終為球形。 ? 優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，培養(yǎng)效率高，利于大量生產(chǎn)，與培養(yǎng)基充分接觸無(wú)需消化傳代，易于收獲細(xì)胞。 ? 缺點(diǎn)是不如貼附生長(zhǎng)型觀察方便，而且并非所有的培養(yǎng)細(xì)胞都能懸浮生長(zhǎng)。 ? ?? 貼壁細(xì)胞經(jīng)懸浮適應(yīng)后也可以長(zhǎng)期懸浮培養(yǎng) ＊ 實(shí)際情況下，所培養(yǎng)的細(xì)胞并不一定呈現(xiàn)某種典型的形態(tài)，能影響細(xì)胞形態(tài)的因素很多，細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征僅是對(duì)培養(yǎng)物判斷或識(shí)別的一種參考性指標(biāo)，如果想明確某一培養(yǎng)物的確切類型，必須借助于更為特異的鑒定方法。 ?影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的因素 血清成分、培養(yǎng)基成分、添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度等。 如 ,Hela細(xì)胞原本是一種上皮型癌細(xì)胞 ,但在過(guò)酸或過(guò)堿的條件下培養(yǎng) ,可以呈現(xiàn)梭形 ,當(dāng)酸堿度適中時(shí)又可以恢復(fù)上皮型特征。 (二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn) 貼附和伸展 接觸抑制 密度抑制 1．貼附 貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)。 ? 貼附底物：其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。一類特殊的促細(xì)胞附著的物質(zhì)（如基膜素、纖維連接素、 Ⅲ型膠原、血清擴(kuò)展因子等）可能參加細(xì)胞的貼附過(guò)程。 ? 培養(yǎng)細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)。 ? 細(xì)胞貼附和伸展過(guò)程： 貼附過(guò)程：促細(xì)胞附著因子吸附于底物上 懸浮的圓形細(xì)胞與底物附著 細(xì)胞將伸展成其原來(lái)的形態(tài) 。 貼附過(guò)程 ? 影響細(xì)胞的貼附和伸展的因素：細(xì)胞因素；生物因素（如促附著因子）； 機(jī)械、物理因素（如低溫或培養(yǎng)液的流動(dòng)過(guò)快 )；其它一些因素的影響（例如：離子的作用 ). ? 可采取的措施：①包被；②減少接種時(shí)細(xì)胞懸液的量；③培養(yǎng)液中離子成分及濃度④培養(yǎng)液的溫度 2．接觸抑制（ Contact inhibition） 細(xì)胞從接種到長(zhǎng)滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。 ? 一般的正常細(xì)胞并不互相重疊于其上面而生長(zhǎng)；但是，轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌瘤細(xì)胞則接觸抑制下降，他們互相之間可在上面或下面經(jīng)過(guò)而重疊生長(zhǎng)。 密度依賴性 （ Density inhibition） ? 3T3細(xì)胞系，在細(xì)胞稀少狀態(tài)下培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)迅速；但一旦細(xì)胞生長(zhǎng)匯合成一片時(shí)（每 6cm培養(yǎng)皿約 106個(gè)細(xì)胞），其分裂增殖停止。其確切的細(xì)胞密度常與培養(yǎng)液中的血清濃度有關(guān)。上述這種生長(zhǎng)特性即為密度依賴性調(diào)節(jié)（或密度抑制）。 ? 轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞則與正常細(xì)胞不同，他們的密度依賴性調(diào)節(jié)常常降低，因而可以生長(zhǎng)至較高的終末細(xì)胞密度。 （四） 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過(guò)程 單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程： 與體內(nèi)細(xì)胞周期相似，經(jīng)歷 G S、 G M期。 細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng) 細(xì)胞分裂時(shí)間為 12～ 48h， 細(xì)胞的分裂 周期 =間期 +分裂期 間期（ G1+S+G2） 分裂期（ M） 體外培養(yǎng)細(xì)胞壽命的過(guò)程可分為三個(gè)階段 原代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期 細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程： (1)原代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)） ? 為新鮮組織自體內(nèi)取出接種培養(yǎng)至第一次傳代的階段 ,一般持續(xù) 1~4周。 ? ?? 特點(diǎn)：原代細(xì)胞培養(yǎng)通常為異質(zhì)性，細(xì)胞獨(dú)立生存性差，多呈二倍體核型，更能代表其來(lái)源組織的細(xì)胞類型及組織特異性，是檢測(cè)藥物的很好實(shí)驗(yàn)工具。 (2)傳代期 ? 當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)增殖一段時(shí)間，達(dá)到一定的細(xì)胞密度后，就應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞分離成兩部分（或更多）至新的培養(yǎng)器皿中，并補(bǔ)充更新培養(yǎng)液，此即為傳代。 ? 特點(diǎn) :在細(xì)胞整個(gè)生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)， 一般情況下，可傳代 10～ 50代。 細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，被稱為二倍體核型。 ? 有限細(xì)胞系和永久細(xì)胞系 ? 動(dòng)物細(xì)胞離體培養(yǎng)起始物，我們稱之為原代培養(yǎng)（ primary culture）。經(jīng)繼代培養(yǎng)后即成為有限細(xì)胞系 (finite cell line)。 ? 有限細(xì)胞系： 細(xì)胞自動(dòng)物體內(nèi)取出后，在培養(yǎng)中僅持續(xù)生長(zhǎng)有限時(shí)間，然后將自行停止生長(zhǎng)。即使提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（包括血清），最終也會(huì)死亡。這種壽命僅能維持一段時(shí)間的細(xì)胞系，稱為有限細(xì)胞系。 ? 大多數(shù)細(xì)胞系在有限的代數(shù)內(nèi)以不變的形式增殖，當(dāng)超過(guò)有限世代后 ，它們可能有兩種情況，一是衰老死亡，二是發(fā)育成永久細(xì)胞系或稱連續(xù)細(xì)胞系。 ? 有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過(guò)度期稱為轉(zhuǎn)換期 (crisis)，其轉(zhuǎn)換過(guò)程在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中稱為體外轉(zhuǎn)化 (in vitro transformation)。 ? 永久細(xì)胞系有如下特征：細(xì)胞形態(tài)變化，如細(xì)胞變小，黏附性減少，具有較高的核質(zhì)比；生長(zhǎng)速率增加，倍增時(shí)間縮短；對(duì)血清的依賴性減?。毁N壁依賴性降低；細(xì)胞異倍體和非整倍體增加，細(xì)胞接種到體內(nèi)后，生癌率上升。 熒光原位雜交顯示端粒 結(jié)果：細(xì)胞群體中具有迅速增殖能力的細(xì)胞將漸占優(yōu)勢(shì)而非增殖的或增殖緩慢的細(xì)胞將被減弱。 (3)衰退期，此期細(xì)胞雖仍存活，但增殖基本停止，細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生衰退、死亡。 ??? 細(xì)胞在第二期末或第三期初階段，通過(guò)所謂“危機(jī)期” (crisis)，獲得不死性而具有持久或無(wú)限增殖的能力。失去接觸抑制。 每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程 在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中，繁殖到一定密度后，將之分開(kāi)而移至新的培養(yǎng)皿中稱為接種。 細(xì)胞”一代”：僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一 段時(shí)間。 潛伏期 每代細(xì)胞的生長(zhǎng)階段 ： 指數(shù)生長(zhǎng)期 停止期 ? 培養(yǎng)細(xì)胞傳代的生存期： 1)潛伏期 (latent phase) 2)指數(shù)生長(zhǎng)期 (logarithmic growth phase)又稱對(duì)數(shù)期 試驗(yàn)用 3)平臺(tái)期又稱生長(zhǎng)停滯期 (stagnate phase)。 傳代 1）潛伏期 2） 指數(shù)生長(zhǎng)期 ? 細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最佳，適用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。持續(xù) 3~5天。 ? 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖狀況可以細(xì)胞群體倍增時(shí)間及細(xì)胞分裂指數(shù)等來(lái)判斷。在此階段，若細(xì)胞處于理想的培養(yǎng)條件，將不斷生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞數(shù)量日漸增加。細(xì)胞將接觸而連成一片，漸次鋪滿培養(yǎng)器皿底物，提供細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域逐漸減少甚至消失。因接觸抑制而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)停止、密度抑制而細(xì)胞終止分裂。細(xì)胞不再繁殖而進(jìn)入平臺(tái)期。 3 平臺(tái)期 ? 又稱生長(zhǎng)停滯期。 ? 此期細(xì)胞生長(zhǎng)的底物面積已被生長(zhǎng)的細(xì)胞所占滿，細(xì)胞量和密度達(dá)到飽和，細(xì)胞停細(xì)胞雖尚有活力但已不再分裂增殖，細(xì)胞數(shù)量持平。 ? 特點(diǎn)細(xì)胞雖已停止生長(zhǎng)，但仍存在代謝活動(dòng)并可繼續(xù)存活一定的時(shí)間。若及時(shí)分離培養(yǎng)、進(jìn)行傳代，將細(xì)胞分開(kāi)接種至新的培養(yǎng)器皿并補(bǔ)充以新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞將于培養(yǎng)器皿中成為下一代的細(xì)胞而再次繁殖。否則細(xì)胞因中毒而發(fā)生死亡。 第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的方法 一、體外培養(yǎng)的一般過(guò)程 二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 四、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例 五、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 一、體外培養(yǎng)的一般過(guò)程 ?體外細(xì)胞培養(yǎng)一般過(guò)程： 組織獲得 → 組織消化 → 接種 →培養(yǎng) →傳代及細(xì)胞凍存復(fù)蘇等 動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官 細(xì)胞懸液 胰蛋白酶 1代細(xì)胞 原代培養(yǎng) 50代細(xì)胞 傳代培養(yǎng) 無(wú)限傳代 單個(gè)細(xì)胞 加培養(yǎng)液 動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。 （分解彈性纖維） 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過(guò)程 過(guò)程 組織 取材 組織細(xì)胞的 分離 培養(yǎng) 機(jī)械法 消化法 機(jī)械法分離胚胎 （二）、 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù) 原代培養(yǎng)分為兩種： 1） 組織塊培養(yǎng)法 2） 組織消化培養(yǎng)（單層培養(yǎng)法）：適用于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、羊膜、上皮、肝腎及傳代細(xì)胞等。 ? 一般而言幼體組織比老齡組織，分化低的比分化高，腫瘤組織比正常組織易于培養(yǎng)。 （一）取材 ⑥ ① ② ③ ④ ⑤ 基本步驟：無(wú)菌取出目的組織 ↓ 用利刀無(wú)菌切割成 1～ 2mm小塊 ↓ 以 Hanks液漂洗干凈 ,低速離心，棄上清 移入培養(yǎng)瓶，加入適當(dāng)培養(yǎng)基浸潤(rùn) ↓ 培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn) 1800，置 15～ 30分，使其貼壁 ↓ 培養(yǎng)瓶翻回，置于 37℃ 培養(yǎng) （ 1）組織塊培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng)法 a：取材修剪沖洗 b：剪切成 1mm3左右的小塊 c：移入培養(yǎng)瓶 d：分布組織小塊間距 5mm e：翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液 37℃ 靜止 12h f：翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng) g：原代細(xì)胞生長(zhǎng) 取材分離和組織消化 無(wú)菌取出目的組織 ↓ 用利刀無(wú)菌切割成細(xì)塊 ↓ 胰蛋白酶液消化 ↓ Hanks液漂洗兩次，低速離心棄上清 ↓ 吸管吹打分散細(xì)胞 ↓ 移入培養(yǎng)瓶薄層培養(yǎng) (2)組織消化培養(yǎng) 加入 3050倍體積 %濃度胰蛋白酶溶液 37℃ 消化 3060min，每 510min搖動(dòng)一次 相關(guān)酶類包括：胰蛋白酶、膠原酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等，需根據(jù)酶及組織成分的特點(diǎn)選擇使用 原代培養(yǎng)與檢查 ? 接種、培養(yǎng) ? ↓ ? 常規(guī)檢查 （檢查細(xì)胞形態(tài)及活力、檢查營(yíng)養(yǎng)液 pH及污染） 傳代培養(yǎng)技術(shù) ? 傳代：當(dāng)原代培養(yǎng)成功后，細(xì)胞分裂增殖成片時(shí)，需要對(duì)其分離重新培養(yǎng)，這一操作過(guò)程成為傳代。 ? 第一次傳代時(shí)間 ： 有 8090%或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞是傳代的理想時(shí)期。過(guò)早產(chǎn)量不足，過(guò)晚細(xì)胞狀態(tài)不佳。 基本步驟： 吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液 ↓ 加入胰蛋白酶和 EDTA混和液 (以能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)） ↓ 吸出消化液，加入培養(yǎng)液終止消化 ↓ 吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散成懸液，計(jì)數(shù)