【正文】 NH3 等。 溫度 溫度對被測溶液的熒光強度有明顯的影響。當溫度升高時，介質粘度減小，分子運動加快，分子間碰撞幾率增加，從而使分子無輻射躍遷增加，熒光效率降低。故降低溫度有利于提高熒光效率及熒光強度。 由于熒光儀器光源的光強度大 、 溫度較高 ， 容易引起溶液溫度升高 ， 加之分析過程中室溫可能發(fā)生變化 ， 從而導致熒光強度改變 。 另外 ，有些熒光物質的溶液在激發(fā)光較長時間的照射下 ， 還會發(fā)生光分解 ， 使熒光強度下降 。 因此 ，試樣不應長時間受光照射 ， 只在測定熒光強度時才打開光閘 ， 其余時間應關閉 。 在較高檔的熒光分光光度計中 ， 樣品室四周設有冷卻水套或配有恒溫裝置 ， 以使溶液的溫度在測定過程中保持恒定 。 溶劑 ： 同一種熒光物質在不同的溶劑中 ， 其熒光光譜的位置和熒光強度可能會有一定的差別 ， 尤其是那些分子中含有極性取代基的熒光物質 ， 它們的熒光光譜易受溶劑的影響 。 溶劑的影響可以分為一般溶劑效應和特殊溶劑效應 。 一般溶劑效應是指溶劑極性的影響 。 通常情況下 ，隨著溶劑極性增大 ， ?～ ?* 躍遷所需的能量差 ?E減小 ， 躍遷幾率增加 ，從而使熒光波長長移 ， 熒光強度增大 。 特殊溶劑效應是指溶劑與熒光物質形成化合物 ， 或溶劑使熒光物質的電離狀態(tài)改變 ， 使熒光峰的波長和熒光強度都發(fā)生較大變化 。 如在萘胺的乙醇溶液中加入鹽酸 ， 隨著溶液中鹽酸濃度的增加 ，萘胺的 — NH2基逐漸被 — NH3Cl基所代替 ，而 — NH3Cl基對萘環(huán)特征頻率的影響小于 — NH2， 因此溶液的熒光光譜趨近于萘的熒光光譜 。 pH值 ： 溶液的酸度 （ pH值 ） 對熒光物質的影響可以分兩個方面： 1． 若熒光物質本身是弱酸或弱堿時 ，溶液 pH值改變 ， 物質分子和其離子間的平衡也隨之發(fā)生變化 ， 而不同形體具有其各自特定的熒光光譜和熒光效率 。 例如苯胺 N H 3 N H2N HO HO HH+H++pH ＜ 2 pH 7 ～ 12 pH ＞ 13無熒光（離子形式） 藍色熒光（分子形式） 無熒光（離子形式）2. 對于金屬離子與有機試劑生成的熒光配合物 ， 溶液 pH值的改變會影響配合物的組成 ， 從而影響它們的熒光性質 。例如 Ga3+離子與鄰 二羥基偶氮苯 ， 在pH3～ 4的溶液中形成 1:1配合物 ， 能產生熒光 。 而在 pH6～ 7的溶液中 ， 則形成 1?2的配合物 ， 不產生熒光 。 總之 ， 溶液 pH值對熒光物質的熒光光譜 、 熒光效率及熒光強度均有影響 。需通過條件實驗找出 pH與熒光強度的關系 ， 確定最適宜的 pH范圍 ， 以提高分析的靈敏度和準確度 。 熒光熄滅 由于熒光物質分子間或與其它物質相互作用 ， 引起熒光強度顯著下降的現象叫做熒光熄滅 （ quenching） 或猝滅 。 引起熒光熄滅的物質稱為熒光熄滅劑 ， 如鹵素離子 、 重金屬離子 、 氧分子 、 硝基化合物 、 重氮化合物和羧基化合物等 。 造成熒光熄滅的原因有多種： （ 1） 激發(fā)態(tài)熒光分子和熄滅劑分子碰撞 ， 將能量轉移到熄滅劑而使熒光熄滅；（ 2） 熒光分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配合物； （ 3） 熒光物質分子中引入重原子后 ， 易發(fā)生系間竄越而轉變?yōu)槿貞B(tài)； （ 4） 當熒光物質濃度較大時 ， 激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子發(fā)生碰撞 ， 產生 熒光自熄滅現象 。 溶液濃度越高 ， 自熄滅現象越嚴重； （ 5） 溶液中溶解的氧分子能引起幾乎所有的熒光物質產生不同程度的熒光熄滅 。 熒光熄滅是熒光分析的不利因素 。 但是如果一個熒光物質在加入某種熄滅劑后 ， 熒光強度的減小和熄滅劑的濃度呈線性關系 ， 則可以利用這一性質建立熄滅劑的熒光分析法 ， 稱為熒光熄滅法 。 熒光熄滅法比直接熒光法更靈敏 、 更有選擇性 。 例如鋁 桑色素配合物的熒光強度因微量氟離子的存在而引起熒光熄滅 ， 利用這種性質可測定樣品中微量氟離子的含量 ， 這時溶液的熒光強度和氟離子濃度成反比 。 散射光 （ scattering light） 當一束光照射在被測溶液上 ， 其中一部分光被吸收后發(fā)出熒光 ， 一部分光透過溶液 ， 還有一小部分光則由于光子與溶劑分子的相互碰撞 ， 使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同方向散射 ， 稱為散射光 。 1. 瑞利 （ Reyleigh） 散射光 光子和物質分子發(fā)生彈性碰撞 ， 不發(fā)生能量的交換 ， 只是光子運動方向發(fā)生改變 ，其波長和激發(fā)光相同 ， 這種散射光稱為瑞利散射光 。 它的強度與波長的四次方成反比 ， 即波長越短 ， 瑞利散射光越強 。 但因瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同 ， 只要選擇適當的熒光測定波長或選用濾光片即可消除其影響 。 2. 拉曼 （ Raman） 散射光 光子和溶劑分子發(fā)生非彈性碰撞 ， 在運動方向發(fā)生改變的同時 ， 光子與溶劑分子還發(fā)生能量的交換 ， 使光子能量減小或者增加 ， 光的波長增長或變短 ， 這兩種散射光均稱為拉曼 （ 散射 ） 光 。 其中波長較長的拉曼光因其波長與物質的熒光波長相接近 , 故對測定的干擾較大 。 由于拉曼光波長隨激發(fā)光波長的改變而改變 , 而熒光物質的熒光波長與激發(fā)光波長無關 , 故通過選擇適當的激發(fā)光波長 ， 就可以將二者區(qū)分開 。 320nm 320nm 448nm 350nm 448nm 350nm 400nm 360nm 激發(fā) 320nm硫酸奎寧 激發(fā) 350nm硫酸奎寧 散射光譜 散射光譜 第二節(jié) 定性定量分析 一、熒光強度與溶液濃度的關系 分光光度法是測定物質對光的吸收程度；熒光分析法是測定物質吸收了一定頻率的光之后，物質本身所發(fā)射的熒光強度。當溶液中的熒光物質被入射光激發(fā)后，可以在各個方向觀察到熒光，由于激發(fā)光一部分可透過溶液，所以在透射光方向觀察熒光是不適宜的，一般是在與透射光垂直的方向觀察熒光。 測定熒光強度時，要選擇兩個不同的波長：一個是物質吸收的光，即激發(fā)光的波長；另一個是被激發(fā)物質發(fā)射的光，即熒光的波長。 溶液的熒光強度與該溶液對光的吸收程度以及溶液中熒光物質的熒光效率有關。 根據 Beer定律 a b cII ? 100所以 )101(00 a b ca IIII ??abcII ? 100 由于溶液的熒光強度與溶液對光的吸收程度及熒光效率成正比，即 aΦIF ?)101( 0 abcIΦKF ?)1( abceIK Φ ?)101(00 a b ca IIII ???????!2)()(12 abcabce abc)1( a b ceIK ΦF ?]}!2)()(1[1{ 20 ?????abcabcIK ΦF]!2)([ 20 ????abcabc IK ΦF當 abc≤（即溶液很?。r， ]!2)([ 20 ????a b ca b cIK ΦFa b cIK ΦF 0 ?對于一定的熒光物質，當測定條件固定時， cKF 39。?即對一定的熒光物質的稀溶液（ abc≤），在一定的溫度下，當激發(fā)光的波長、強度和液層厚度都固定后，其熒光強度與該溶液的濃度成正比。這是熒光分析定量的基礎。 二、定性分析 熒光物質的特征光譜包括激發(fā)光譜和熒光光譜，因此用它鑒定物質比吸收光譜可靠。 三、定量分析 1. 標準曲線法 F c Fx cx 2. 直接比較法 如果熒光物質的標準曲線過零點，且線性良好，可用直接比較法測定。 ss KcFF ? 0xx KcFF ? 0xsxsccFFFF?00 sxsx cFFFFc ??00第三節(jié) 儀器 一、儀器的構造及原理 儀器類型很多，基本結構相似，一般包括五部分：激發(fā)光源、單色器、樣品池、檢測器和記錄顯示部分。 1. 光源 能發(fā)射紫外到可見區(qū)波長的光、強度大、穩(wěn)定。常用的有溴鎢燈、高壓汞燈、氙燈。 2. 單色器 兩個單色器 3. 樣品池 通常用石英制成 4. 檢測器 光電倍增管 二、儀器類型 1. 光電熒光計 用濾光片作單色器（激發(fā)濾光片和熒光濾光片），溴鎢燈或高壓汞燈作光源，光電管為檢測器。 2. 熒光分光光度計 用氙燈作光源