【正文】 條件 :水平震蕩 ,合適的氣體組成 /pH 特點 :對剪切力敏感 結(jié)團 生長速度慢 多泡沫 光照 無菌培養(yǎng) 圖 122大規(guī)模植物細胞固定化裝置 含 CaCl2的培養(yǎng)基 蓋子 空氣出口 海藻酸鈉 +細胞懸浮液 噴嘴 無菌空氣入口 大規(guī)模固定化植物細胞的大規(guī)模固定化原則上可根據(jù)上述方法進行 ， 但是不能再用塑料注射器 ，而需要采用如圖 122所示的大規(guī)模細胞固定化裝置進行細胞的固定化 。 動物細胞工程 應(yīng)用 動物細胞培養(yǎng) 動物細胞融合 單克隆抗體技術(shù) 核移植 動物細胞工程常用技術(shù) 人耳鼠 “人耳鼠 ” 再出風頭 2022年，一只特別的活老鼠在北京引起轟動 ——這是有著一對紅眼睛的、尾巴長長的、渾身沒毛的小白鼠。值得一提的是，這只小白鼠的背上，竟長著一只幾乎與身子一般大小的 “ 人耳 ” 。這只老鼠背上的 “ 人耳 ” 是由上海市第九人民醫(yī)院副院長、整復(fù)外科主任曹誼林教授利用組織工程技術(shù)復(fù)制出來的。 在京展出的數(shù)天，盡管門票高達 20元，但還是有將近 20萬人，心甘情愿地掏錢一睹 “ 人耳鼠 ” 的風采。 人耳鼠的出現(xiàn)，透露了怎樣的信息？ : 20世紀初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)向外突出形成的，還是由神經(jīng)細胞周圍的其他細胞融合而成的。生物學(xué)家們就這個問題展開了激烈的爭論。 1907年，美國生物學(xué)家哈里森 (Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細胞中長出了神經(jīng)纖維。哈里森的實驗不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問題，而且開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河。此后，在許多科學(xué)家的不懈努力下，動物組織培養(yǎng)不斷改進并逐漸發(fā)展成為動物細胞培養(yǎng)。 動物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念： 動物細胞培養(yǎng)就是從動物有機體中取出相關(guān)的組織 ,將它分散成單個細胞 ,然后 ,放在適宜的培養(yǎng)基中 ,讓這些細胞生長和增殖 . 動物細胞的培養(yǎng)過程 幼齡動物 取動物器官 和組織 剪碎組織 胰蛋白酶處理 細胞培 養(yǎng) 單個細胞 動物細胞培養(yǎng)技術(shù) 是其他動物細胞工程技術(shù)的基礎(chǔ) 剪碎組織的目的？ 胰蛋白酶處理的目的？ 動物細胞培養(yǎng)過程： 動物胚胎或幼齡動物的組織、器官 細胞懸浮液 胰蛋白酶 10代細胞 原代培養(yǎng) 50代細胞 傳代培養(yǎng) 細胞株 無限傳代 細胞系 單個細胞 加培養(yǎng)液 遺傳物質(zhì)未改變 遺傳物質(zhì)已改變 動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。 （分解彈性纖維） 有關(guān)概念 ?原代培養(yǎng) ：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。（分裝前的細胞培養(yǎng)） ?傳代培養(yǎng) ： 將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。 有關(guān)概念 細胞株： 傳代培養(yǎng)的細胞一般傳至 10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到 40~50代，這種傳代細胞為細胞株。 細胞系： 細胞株傳代至 50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。 細胞株和細胞系的區(qū)別 ： 細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。 動物組織細胞培養(yǎng)要求 一 體外培養(yǎng)特點 : 大多數(shù)動物細胞要附在物體上表面生長，動物細胞培養(yǎng)對營養(yǎng)要求更嚴格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖外，還需要血清。對環(huán)境適應(yīng)性差，對環(huán)境敏感，包括：PH、溶解氧、溫度、剪切力等比微生物要求更高。 二 培養(yǎng)工具 : ?培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管、 多孔培養(yǎng)板 等。 細胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主。 器皿應(yīng)選擇透明度好、無毒、 中性硬度玻璃制品。 ? 根據(jù)培養(yǎng)細胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細胞傳代培養(yǎng)的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于 1cm，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位。 ? ? 三 、 培養(yǎng)條件 細胞在體外培養(yǎng)中所需的條件 與體內(nèi)細胞基本相同。 【 討論 】 多細胞動物和人體的細胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，討論以下問題： ？ 提示：充足的營養(yǎng)供給、適宜的溫度、適宜的 pH和氣體環(huán)境。 ？ 提示：無菌、無毒的環(huán)境。 1） 恒定的溫度 :37 ℃ ， ? 維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為 ℃ 177。 ℃ ，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過 39℃ 時，細胞代謝與溫度成正比； ? 人體細胞在 3940℃1 小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)； ? 在 4041℃1 小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)； ? 4142℃1 小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復(fù)可能； ? 當溫度在 43℃ 以上 1小時，細胞全部死亡。低溫下會使細胞代謝速率降低 2） PH： ?當 PH低于 6或高于 ，甚至死亡。 用來檢測 PH的變化：紅色 ， ?橙色 ，黃色 ，藍紅色 ，紫色 。 3) 氣體： ?ＣＯ ２ 有調(diào)節(jié) PH的作用。 ?氣體是人體細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體 主要有氧氣和二氧化碳 。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。 開放培養(yǎng)時一般把細胞置于 95%空氣加 5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中 。 4）營養(yǎng) — 培養(yǎng)基： ? 在保證細胞滲透壓的情況下，培養(yǎng)液里的成分要滿足細胞進行代謝所需要的各種營養(yǎng)，如包括十幾種必需氨基酸及其他多種非必需氨基酸、維生素、碳水化合物及無機鹽類等。只有滿足了這些基本條件，細胞才能在體外正常存活、生長。 ? 動物細胞的培養(yǎng)基一般分為天然、合成、無血清培養(yǎng)基幾種，此外細胞培養(yǎng)還需要一些常用的溶液。 合成 培養(yǎng)基 ? 1951年厄爾開發(fā)了供動物細胞體外生長的人工合成培養(yǎng)基 (MEM)。合成培養(yǎng)基的種類相當多。合成培養(yǎng)基成分已知，便于對實驗條件的控制。但與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細胞培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。 ?人工合成培養(yǎng)基，如 109培養(yǎng)液、 DMEM、19 ? RPMI1640， IMEM， MEM培養(yǎng)液等。 天然 培養(yǎng)基 ? 直接采用取自動物體液或從組織中提取的成分作培養(yǎng)液，主要有血清、組織提取液、雞胚汁等。 ? 血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)成分。它含有許多維持細胞生長繁殖和保持細胞生物學(xué)性狀不可缺少的未知成分。 使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，能使細胞碩利增殖生長。 ?常用的動物血清主要有牛血清和馬血清。牛血清分為 胎牛血清和犢牛血清 ，前者來源少，價格高；后者要求剛產(chǎn)下尚未哺乳的小牛，因為哺乳后的小牛血清中可能含有更復(fù)雜的成分。血清中已知的成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白質(zhì)主要是白蛋白和球蛋白。 ?氨基酸是細胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，氨基酸中有 12種是細胞本身不合成的，必須由培養(yǎng)液提供。激素有胰島素、生長激素和多種生長因子如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、增殖刺激因子(MSA)、類胰島素生長因子 (IGFl、 IGF2)等。 ? 水解乳蛋白、膠原 是另外兩種較好的天然培養(yǎng)基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解產(chǎn)物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。一般配制成 0． 5％溶液，微酸性。膠原是從動物真皮中提取的，具改善細胞表面特性促使其附著生長的作用。 無血清培養(yǎng)基 ?動物血清成分復(fù)雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清對細胞生長很有效，但后期對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測造會成一定困難。另外高質(zhì)量的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。 無血清培養(yǎng)基不加動物血清，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細胞生長有效因子，激素等。 5) 細胞 培養(yǎng)溶液 ?平衡鹽水（ BSS）： Hanks 液和 Earle液是常用的 BSS基礎(chǔ)溶液。 ?PH調(diào)整液： NaHCO3溶液、 HEPES溶液 （ 二羥乙基哌嗪乙烷磺酸 ） ?細胞消化液 : 胰蛋白酶溶液． EDTA溶液．膠原酶溶液 ?抗生素溶液： 1)青、鏈霉素 :每毫升培養(yǎng)液含 100U青霉素和100ug鏈霉素 . 2)卡那霉素：終濃度為 50ug/ml培養(yǎng)液。 3） 制霉菌素：濃度 25U/ml，小瓶分裝，每