【正文】 效的方法。天然產物是研究開發(fā)薪藥的重要資源，自 1983～ 1994 年間．約 60％被批準應用的抗癌和抗感染藥物來源于天然產物“’。藍藻是地球上最早出現(xiàn)的光合自養(yǎng)生物，在長期的演化過程中形成了廣泛的適應性。從藍藻中分離具有不同生物活性的次級代謝產物，并以此為先導化合物進行新藥物開發(fā)，已引起藥學工作者極大的關 注。 TMV 是煙草花葉病毒屬 (Tobamovirus)的代表種。該屬病毒為正義單鏈RNA(positiveSENSE singlestrandedRNA， +ssRNA)病毒，病毒復制時正鏈基因組 RNA 首先復制出負鏈 RNA(negmive senseRNA，． RNA)，再以負鏈 RNA 為模版產生正鏈基因組及亞基因組 RNA。病毒粒子為剛直的長桿狀，長 300hm，直徑 18nm，螺旋對稱結構，有 2130 個蛋白亞基以右手螺旋排列，螺距為 2． 3nm，負染色后在電鏡下中央軸槽清晰可見。 抗病毒活性成分 植物病毒是危害農作物的一類重要病原，因其危害大、防治困難，俗有植物癌癥之稱。由于植物病毒對植物細胞的絕對寄生性，病毒復制所需要的物質、能量場所等完全由寄主提供，病毒能夠脅迫寄主細胞的生化機理，使其與病毒本身的生化機理糾纏在一起難以識別，所以藥物難以只對病毒進行選擇性攻擊而不傷害寄主細胞，導致研究高選擇性的化學抗病毒制劑面臨極大的困難，至今仍未取得重大突破。對煙草花葉病 (Tobacco Mosaic Virus，簡稱 TMV)的防治，國內外已做了大量的研究，特剃是在植物抗病毒基因研究上取得了一系列進展，但是由于 遠緣雜交的不親和性，使由抗性基因轉移翡難度很大。其次，農業(yè)栽培措施壺于受耕作制度和社會經濟發(fā)展的限制，在生產中有效的實施仍有一定難度，使用化學或生物制劑防治煙草花葉病不失為一種經濟有效的措施?，F(xiàn)有的藥劑菌奇演、寧南霉素、病毒 A、病毒必克有一定防效 (防效大多在 30,． 60％ )，但藥劑防治效果還不理想。 植物病毒病是影響農業(yè)生產的重要因素之一，全世界每年因植物病毒病害所造成的產量損失大約占糧食總產量的 10％ (Fraser， 1985)。有效地控制病毒的為害是農業(yè)生產上的當務之急。迄今為止，幾乎沒有能有效地 從感染病毒的植物上除去病毒的化學藥劑。有些化學藥劑 (如嘌呤、嘧啶類似物 )能減緩病毒的增殖，但無根除之效，而且常常比病毒更易傷害作物 。 近年來，植物源抗病毒制劑（生物源農藥）由于其高效、低毒、無殘留的特點和優(yōu)勢，在植物病毒病害防治過程中發(fā)揮出越來越重要的作用。自 1925 年Duggur 等從商陸 (phytolacca）上發(fā)現(xiàn)第一個植物病毒抑制物以來 [14]，陸續(xù)開發(fā)了很多抗病毒制劑，像病毒 A、植病靈、金葉寶等。目前研究發(fā)現(xiàn)的抗病毒活性物質，既有生物小分子的次生代謝產物，也有大分子的多糖、核酸和蛋白質等。其中蛋白質類活性物質廣泛存在于自然界各種生物體內，包括植物、微生物、動物等，最受關注，同時也是研究較多的一類活性物質。 動物病毒廣泛侵襲各類動物，對經濟動物也不例外，在家禽家畜養(yǎng)殖中屢見不鮮。在如今的抗動物病毒活性成分化合物中，主要都是黃酮類相關的化合物。黃酮類化合物泛指具有 15個碳原子 (C6C3 一 C6)的多元酚化合物，廣泛存在于自然界中。按結構可分為黃酮和黃酮醇類、雙黃酮類、二氫黃酮及二氫黃酮醇類、查耳酮類、異黃酮類以及其它黃酮類等。許多中草藥的抗病毒活性成分都是黃酮類化合物，如從甘草中分離出的黃酮 類成分甘草素與異甘草素有很強的抑制艾滋病病毒 (HIV)能力，甘草香豆素屬于異黃酮類的衍生物，甘草吡喃香豆素等多種甘草黃酮類成分可抑制 H1V 誘導的巨細胞形成，且未見細胞毒性。自從 1993 年首次從短葉紅豆杉的韌皮部分分離到一株產紫杉醇的內生真菌后，研究者就開始不斷地從內生菌中分離出各種活性代謝產物 ?，這其中就包括抗病毒活性代謝產物。 目前臨床上常用的藥物主要有如下幾種：抗流感病毒及呼吸道病毒藥物：抗皰疹病毒藥物：抗巨細胞病毒藥物；抗肝炎病毒藥物：抗人類免疫缺陷病毒藥物。抗病毒藥物的治療已有近 30 年的歷史， 由于病毒進入機體后，模仿宿主的生化機理在宿主細胞內進行復制和繁殖，因此，能抑制病毒繁殖的藥物對宿主細胞或機體有不同程度的損害，使得抗病毒藥的發(fā)展與抗生素相比較為緩慢。到目前為止，尚無令人完全滿意的抗病毒藥。 目的意義 在農藥的投入上，生物農藥的比重越來越小，工業(yè)化生產出的化學農藥卻逐年增加。 但是 化學農藥的大量使用和長期延續(xù)，已給人類帶來了不利的影響，它不僅嚴重破壞了人們賴以生存的自然環(huán)境，影響了正常的生態(tài)循環(huán)，還危及到人類的健康。如土壤的嚴重板結和酸化，既造成農藥浪費，又破壞土壤結構，降低農作 物產量和品質；還會污染水源，造成江河湖泊水華現(xiàn)象和海洋赤潮；而水的負營養(yǎng)化，對水生動植物的生存造成極大的威脅：地下水與地表水的污染，使農作物的品質下降，嚴重影響到人類的生存與健康。盡量減少化學農藥的使用成為現(xiàn)代農業(yè)生產中人們所十分關心的問題。 因此如何研究出高效，高質，高優(yōu)的化學產品，減少化學藥品的使用量，采用生物農藥，生物防治至關重要。從而在未來的抗病毒，抗真菌，細菌的舞臺上，更多的需要依靠生物菌來防治病害，病毒等，這其中最主要的就是放線菌。 放線菌在自然界的分布極為廣泛 , 存在于各種不同的自然生態(tài)環(huán)境里 , 其種類繁多 , 代謝功能各異 , 是一類有著廣泛實際用途的生物資源 。 放線菌所產生的抗生素能有效地防治人類和牲畜的多種傳染性疾病 。 目前人們在生物體內發(fā)現(xiàn)的 6 000 多種抗生素中 , 約 60%來自放線菌 , 其中包括許多在醫(yī)藥上有重要作用的抗生素 , 因而成為近代抗生素等制藥工業(yè)的最重要的微生物資源之一 。 微生物發(fā)酵的生產水平最基本的是取決于生產菌種的性能 , 但有了優(yōu)良的菌種之后 , 還需要有最佳的環(huán)境條件即發(fā)酵工藝加以配合 , 才能使其生產能力充分表現(xiàn)出來 。 因此必須研究生產菌種的最佳發(fā)酵工藝條件 , 如營養(yǎng)要求 、 培養(yǎng)溫度 、 pH條件 、 對氧的需求等 , 據(jù)此設計出合理的發(fā)酵工藝 , 使生產菌種處于最佳的產物合成條件 , 進而取得優(yōu)質高產的效果 。 本實驗采用抗病毒生防菌 F01菌株，以高氏一號培養(yǎng)基為基礎，作為菌株碳氮源及實驗環(huán)境條件的篩選準則，采取單因素變化，采用梯度實驗初步確定最優(yōu)原料比例和條件。實驗過程中，分別用各種單糖代替 2%的淀粉選出較優(yōu)碳源，同理用氮源代替 %硝酸鉀選出較優(yōu)碳源，然后用較優(yōu)碳源和氮源進行正交實驗，得到最優(yōu)碳源，氮源。利用最優(yōu)碳源，氮源對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化實驗。 最終得出最適合 F01生長的發(fā)酵條件 。 第一章 材料和方法 實驗菌株 F02 菌株； F07菌株； F12 菌株； FZH 菌株。（實驗室保存菌株） 實驗儀器及試劑 實驗儀器 精密電子天平 ， 立式電熱壓力蒸汽滅菌器 ， 數(shù)顯酸度計 ， 凈化工作臺 ，移液槍，錐形瓶，研缽，恒溫培養(yǎng)箱，搖床， 量筒，冰箱 實驗試劑 淀粉，果糖，麥芽糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖，玉米粉，小米粉，大米粉，黃豆粉，蛋白胨，大豆蛋白胨，酪蛋白胨，硝酸鉀，硫酸銨 ， K2HPO4， MgSO4 7H2O ；NaCl； FeSO4 7H2O ； 氯化鉀 ， TMV 病毒液。 培養(yǎng)基 放線菌培養(yǎng)基 (高氏 1 號培養(yǎng)基 )： 淀粉（ 2g） KNO3() K2HPO4 () () NaCl () () 水 100mL 實驗方法 菌株培養(yǎng)方法：以高氏一號培養(yǎng)基為菌株提供生長環(huán)境，采用統(tǒng)一規(guī)格的錐形瓶（