【正文】 B9 T738 水解糖 玉米漿 磷酸氫二鉀 硫酸鎂 尿素 Fe++（ ppm） Mn++（ ppm） pH 2 2 2 2 2 2 2 2 (2)培養(yǎng)條件 接種量： ~％ 培養(yǎng)溫度： 32~34℃ 培養(yǎng)時間： 7~8h 通風(fēng)量： 50L 種子罐 1: 攪拌轉(zhuǎn)速 340r／ min； 250L 種子罐 1: 攪拌轉(zhuǎn)速 300r／ min 500L 種子罐 1: 攪拌轉(zhuǎn)速 230r／ min (3)二級種子的質(zhì)量要求 種齡： 7~8h pH： 左右 OD 值凈增 左右 無菌檢查 () 噬菌體檢查 () 二、啤酒酵母的 擴大培養(yǎng) 一般可采用三級擴大培養(yǎng)，擴大倍數(shù)：第 1 級到第 2 級為 810 倍，第 2 級到第 3 級為 46 倍。 1，實驗室擴大培養(yǎng) 2，車間擴大培養(yǎng) 第三節(jié) 生產(chǎn)發(fā)酵罐的無菌接種 生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個方面：從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入一個種子罐；從一個種子罐移入另一個生產(chǎn)發(fā)酵罐中。 （ 1）從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種 通常有兩種方式 2，從種子罐接種 第四節(jié) 菌種的保藏與復(fù)壯 一、菌種的保藏 菌種保藏的意義 菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。 菌種保藏的原理 菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平 缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于 ―體眠 ‖狀態(tài)，抑制其繁殖能力。 一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟，以便生產(chǎn)上能推廣使用。 菌種保藏的方法 （ 1）斜面低溫保藏法 將菌株接種于合適斜面培養(yǎng)基上，待生長好后置于 4 冰箱保藏，每隔一定時間進行移接培養(yǎng)后再將新斜面繼續(xù)保藏。 這種保藏方法簡單，存活率高，易于推廣，經(jīng)常使用的菌種可采用這種方法。其缺點是菌種仍有一定強度的代謝活動條件，保存時間不長，而且傳代多，因此菌種客易產(chǎn)生變異。 （ 2）石蠟油封保藏法 將生長 好的新鮮斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層要高出斜面上端 1cm，使之與空氣隔絕，然后垂直放于室溫或冰箱內(nèi)保藏即可。 這種方法也比較簡便，且保藏時間一般可長達 l年以上。適于保存部分霉菌、酵母菌、放線菌，但對細菌效果較差，對某些能同化烴類的微生物則不適用。 （ 3）砂土管保藏法 將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至滅過菌的砂土管中，于真空干燥器內(nèi)用真空泵抽干，再轉(zhuǎn)至有干燥劑的容器中，密封低溫保藏。本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于細菌的芽孢、霉菌和放線菌孢子的保藏，不適于對干燥敏感的無芽孢的細菌和酵母菌。 主要包括砂土制備和真空抽干兩步。 （ 4）冷凍干燥法 此法的原理是在低溫下迅速將細胞凍結(jié)以保持細胞結(jié)構(gòu)的完整，然后在真空下使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異和死亡，因而能長期保存，一般為 5~10年。 微生物在此條件下易死亡，所以需加入一些物質(zhì)作保護劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。該法存活率高，變異率低，并能廣泛適用于細菌 （ 有芽孢和無芽孢的 ） 、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是目前廣泛采用的好方法。其缺點是手續(xù)麻煩，操作復(fù)雜，要求嚴格，并需有一定設(shè)備條件。 （ 5）超低溫保藏法 由于現(xiàn)在超低溫冰箱的使用已較普及，所以菌種的超低溫保藏法在生產(chǎn)企業(yè)和研究機構(gòu)已得到廣泛應(yīng)用。該方法的要點是：將要保藏的菌種置于 10%甘油或二甲基亞砜保護劑中，密封于試管或安瓿管中，然后將其放入超低溫冰箱中于 70℃下保藏。該法簡便易行，而且保藏效果較好。 二、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的衰退與復(fù)壯 微生物具有生命活動能力，其世代時間一般是很短的，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此常常造成工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化，并有可能使優(yōu)良菌種丟失，所以，如何保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定是研究菌種保藏的重要課題。 （一）微生物菌種的衰 退 菌種退化通常是指在較長時期傳代保藏后，菌株的一個或多個生理性狀和形態(tài)特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。常見的菌種衰退在形態(tài)上表現(xiàn)為分生孢子的減少或菌落顏色的改變。在生理上常指菌種發(fā)酵能力的降低，有些菌的抗噬菌體能力下降。對誘變育種而獲得的高產(chǎn)變異株則常表現(xiàn)出恢復(fù)野生型性狀等。但菌種的真正退化必須與由于環(huán)境原因變化而引起菌種形態(tài)、和生理上的變異區(qū)別開來。如培養(yǎng)基中微量元素缺乏會導(dǎo)致孢子數(shù)量減少，也會引起孢子顏色的改變。此外，溫度、 pH、不同碳氮源都會導(dǎo)致菌種變化。但只要一旦恢復(fù)正常條件，這些現(xiàn)象就會消失。此外，雜 菌污染也會造成菌種退化的假象。因此，必須正確判斷是否退化，才能找出正確的解決辦法。一般菌種退化是從量變到質(zhì)變逐漸發(fā)生的，同時也是整個群體中產(chǎn)量降低及其相聯(lián)系的種種特性的變化，而不是指單個細胞的改變。 引起菌種退化的原因主要有： 基因突變 菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負突變則會引起產(chǎn)量下降，如果控制孢子生成的基因發(fā)生負突變則孢子性能就會下降。當(dāng)然，這些負突變都是自發(fā)形成的。經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細胞比休眼狀態(tài)細胞發(fā)生突變的機率大得多。在發(fā)酵生產(chǎn)中常用營養(yǎng)缺陷型突變株，如缺 陷型發(fā)生回復(fù)突變就會使產(chǎn)量水平下降。如粘質(zhì)賽氏桿菌 (Serratia marcescens)H2892 菌株生產(chǎn)力為 18g/L 組氨酸，經(jīng) 5次傳代后因回復(fù)突變型增多，產(chǎn)量下降至4g/L。很多抗生素生物合成、產(chǎn)生氣生菌絲和色素等性狀都部分或全部受質(zhì)粒基因控制。當(dāng)菌株連續(xù)傳代、菌體發(fā)生質(zhì)粒脫落而出現(xiàn)大量光禿型菌落，則生產(chǎn)能力也顯著下降。 變異菌株性狀分離 變異菌株性狀分離也會引起高產(chǎn)型狀的喪失。在菌種篩選工作中經(jīng)常遇到初篩搖瓶產(chǎn)量很高，復(fù)篩產(chǎn)量逐漸下降而被淘汰的現(xiàn)象，在霉菌中更為常見。這是一種廣義的退化現(xiàn)象。 當(dāng)誘變的單菌落是由一個以上孢子或細胞形成，而其中只有一個孢子或細胞是高產(chǎn)時，在移接傳代過程中，這個高產(chǎn)菌株數(shù)量減少，當(dāng)然產(chǎn)量也就下降。即使菌落是由一個孢子或單個細胞形成，只要它是多核細胞，在誘發(fā)突變中核的變化不會都一樣，隨著菌種傳代和核的分離也會使性狀表現(xiàn)多樣化，產(chǎn)量也會隨之變化，即使是單核孢子發(fā)生突變時，如果雙鏈 DNA 上僅一條鏈上某個位點發(fā)生變化，經(jīng)移殖后也會出現(xiàn)性狀分離。因此一個較穩(wěn)定的變異株的獲得必須經(jīng)過多次分離純化。為了得到較多純種，有人考慮提高誘變劑量，使單核細胞 DNA 雙鏈中一條鏈的某一點發(fā)生突變 ，另一條鏈完全失活不再復(fù)制來提高純菌產(chǎn)生率。通過實驗得到下表所示數(shù)據(jù)。 不同劑量紫外線處理裂殖酵母時不純菌落百分數(shù) 劑量 （以存活率計， %） 菌落總數(shù) 突變菌落數(shù) 突變頻率 （突變菌落 /103） 不 純 菌 落（ %） 純 不純 100（對照） 80~100 60~80 20~60 1~20 12165 12060 8553 4922 9884 1 13 46 65 195 — 12 20 17 28 2 27 — 43 30 21 13 誘變突變株的穩(wěn)定性和誘變劑作用機 制有關(guān)，一般認為誘發(fā) DNA 堿基轉(zhuǎn)換或顛換時不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較多，而誘發(fā)缺失交界時不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較少，因為缺失是不能回復(fù)的。 連續(xù)傳代 連續(xù)傳代也是菌種退化的直接原因。個別細胞性狀改變不足以引起菌種退化，經(jīng)多次傳代，退化細胞在數(shù)量上占優(yōu)勢，于是退化性狀表現(xiàn)逐步明朗化，最終成為一株退化菌株。以芽孢桿菌的黃嘌呤缺陷型在斜面上移殖代數(shù)對回復(fù)突變率和產(chǎn)量的關(guān)系為例，如下表所示。 產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系 實驗 移接代數(shù) 每代斜面保存時間（天） 回復(fù)子比數(shù) 腺苷產(chǎn)量 （ g/L） 1 2 3 4 5 6 0 2 6 7 9 12 147 133， 14 47， 3， 9， 3， 71， 14 47， 3， 9， 3， 13， 58， 14 47， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 47， 4 47， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 4， 14， 6， 6， 31 1/ 106 1/ 106 1/ 105 1/ 105 1/ 103 1/ 103 由上表可見，雖菌種總的保存時間都是 147 天，但隨著移植代數(shù)的增加，回復(fù)突變率也增加，腺 苷產(chǎn)量下降。這也說明，退化并不突然明顯，而是當(dāng)退化細胞在繁殖速率上大于正常細胞時，每移植一代，使退化細胞的優(yōu)勢更為顯著，從而導(dǎo)致退化。 其它因素 其它如溫度、濕度、培養(yǎng)基成分及各種培養(yǎng)條件都會引起菌種的基因突變。例在保藏菌種中基因突變率就隨溫度降低而減少，又例在產(chǎn)腺苷的黃膘吟缺陷型 中，若在培養(yǎng)基中加入黃嘌呤、鳥嘌呤及組氨酸和蘇氨酸可降低回復(fù)突變的數(shù)量。 （二）防止菌種衰退和退化菌種的復(fù)壯 防止菌種衰退 防止菌種衰退的方法有： （ 1）控制傳代次數(shù) 基因的變化往往發(fā)生在復(fù)制和繁殖過程中，繁殖越頗繁，復(fù) 制的次數(shù)越多，基因發(fā)生變化的機會也就越多。因此應(yīng)該盡量避免不必要的接種和傳代，把傳代次數(shù)控制在最低水平，以降低突變機率。一般情況下，斜面每移植一代，霉菌、放線菌、芽孢桿菌在低溫下可保藏半年左右，酵母可保藏 3 個月左右，無芽孢細菌可保藏 1 個月左右。為此，生產(chǎn)菌種每移植一代，最好同時移植較多的斜面，以供一段時間生產(chǎn)之需，這樣移植次數(shù)就可減少。 （ 2）選擇合適的培養(yǎng)條件 培養(yǎng)條件對菌種衰退有一定的影響，選擇一個適合原種生長的條件可以防止菌種衰退。另外，生產(chǎn)上應(yīng)避免使用陳舊的斜面菌種。 （ 3）利用不同類型的細胞進行傳 代 在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細胞常含有許多核，甚至是異核體，因此用菌絲接種時就會出現(xiàn)衰退和不純的子代。而孢子一般是單核的，利用孢子來接種，可以達到防止衰退的目的。但是這也必須注意到微生物細胞本身的特點。對構(gòu)巢曲霉來說，利用它的分生孢子傳代易發(fā)生衰退而用它的子囊孢子移種則不易退化。 （ 4）選擇合適的保藏方法 采用有效的菌種保藏方法也可以防止菌種的衰退。 由于菌種衰退的情況不同，對有些衰退原因還不甚了解，因此要切實解決具體問題，需根據(jù)實際情況，通過實驗正確地加以運用。 退化菌種的復(fù)壯 使衰退的菌種重 新恢復(fù)原來的優(yōu)良特性，稱為復(fù)壯。常用的方法是對已退化菌株用一定培養(yǎng)條件進行單細胞分離純化。從而限制退化菌株在數(shù)量上占優(yōu)勢，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得得以復(fù)壯。例如用高劑量 UV或再配以低劑量 NTG對退化菌株進行處理，可得到較多的純菌落，又如選擇一種對退化型菌株細胞核具有更大殺傷力的誘變劑亦可使原菌株得到復(fù)壯。但這工作量不亞于新突變株的誘變育種，另外，用遺傳方法選育不易退化的穩(wěn)定菌株或采用雙缺、三缺菌株及減少傳代次數(shù)等方法，都可防止菌種退化，保存穩(wěn)定菌株。 第八章 發(fā)酵過程 發(fā)酵過程即細胞的生物反應(yīng) 過程，是指由生長繁殖的細胞所引起的生物反應(yīng)過程。它不僅包括了以往 ―發(fā)酵 ‖的全部領(lǐng)域，而且還包括固定化細胞的反應(yīng)過程、生物法廢水處理過程和細菌采礦等過程。 微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，而且要賦以合適的環(huán)境條件才能使它的生產(chǎn)能力充分表達出來。為此我們必須通過各種研究方法了解有關(guān)生產(chǎn)菌種對環(huán)境條件的要求，如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、 pH、氧的需求等，并深入地了解生產(chǎn)菌在合成產(chǎn)物過程中的代謝調(diào)控機制以及可能的代謝途徑，為設(shè)計合理的生產(chǎn)工藝提供理論基礎(chǔ)。同時，為了掌握菌種在發(fā)酵過程中的代謝變化規(guī)律，可以 通過各種監(jiān)測手段如取樣測定隨時間變化的菌體濃度，糖、氮消耗及產(chǎn)物濃度，以及采用傳感器測定發(fā)酵罐中的培養(yǎng)溫度 pH、溶解氧等參數(shù)的情況，并予以有效地控制，使生產(chǎn)菌種處于產(chǎn)物合成的優(yōu)化環(huán)境之中。 第一節(jié) 發(fā)酵過程的代謝變化規(guī)律 代謝變化就是反映發(fā)酵過程中菌體的生長，發(fā)酵參數(shù)（培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件等）和產(chǎn)物形成速率三者間的關(guān)系。 了解生產(chǎn)菌種在具有合適的培養(yǎng)基、 pH、溫度和通氣攪拌等環(huán)境條件下對基質(zhì)的利用、細胞的生長以及產(chǎn)物合成的代謝變化，有利于人們對生產(chǎn)的控制。 代謝曲線：代謝變化是反映發(fā)酵過